初代脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)高分子-PHA 聚合物與摻合物之生物相容性評(píng)估
時(shí)間:2005-06-27
尤明村、呂昀、周秀慧
輔仁大學(xué)生命科學(xué)系（臺(tái)灣）
一、中文摘要
環(huán)境中微生物合成之聚羥基酯類(lèi) (polyhydroxyalkanoates; PHA)聚合物具有”生物分解性”、生物兼容性”及”生物適用性”的特質(zhì)而成為目前最熱門(mén)的塑料取代者。發(fā)展PHA 材料成為塑料取代物的同時(shí)，PHA 高分子材料可研發(fā)成為高價(jià)值的生醫(yī)材料以供生物工程和生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。本計(jì)劃的目的是藉由體外免疫初代細(xì)胞測(cè)試系統(tǒng)評(píng)估對(duì)PHA 聚合物材料對(duì)細(xì)胞是否具毒性以及是否影響免疫反應(yīng)，來(lái)評(píng)估PHB 或PHBV 生物兼容性和應(yīng)用安全性。實(shí)驗(yàn)的方法是將不同濃度PHB 或PHBV 的懸浮液與脾臟制備的初代細(xì)胞作不同時(shí)段的共同培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 PHBV 不會(huì)影響脾臟初代細(xì)胞對(duì)T 或B 淋巴球分裂原的增殖反應(yīng)。而PHB 卻隨濃度增加會(huì)抑制Con A 對(duì)脾臟T 淋巴球的增殖作用。另外，PHB 會(huì)增加脾臟初代細(xì)胞對(duì)NO 的釋放，并且PHB 可抑制LPS 對(duì)脾臟初代細(xì)胞在IL-1α、IL-6 和TNF-α的產(chǎn)生。另外以PHB 或PHBV 制成之薄膜植入老鼠背部皮下的結(jié)果顯示，PHB 或PHBV 不具毒性，也不會(huì)造成植入?yún)^(qū)周邊皮膜和毛發(fā)的異常，此結(jié)果顯示PHB 具生物兼容性與醫(yī)用安全性。
二、簡(jiǎn)介
發(fā)展”生物分解性塑料材料” 是目前發(fā)展生物可分解性的原料時(shí)，這些原料多半為一種生物高分子材料，具生物分解性(biodegradable)、生物吸收性(bioabsorbable)、甚至具生物兼容性(biocompatible)。因而在研發(fā)為”生物分解性塑料材料”同時(shí)，利用生物高分子材料的特質(zhì)可同時(shí)開(kāi)發(fā)具有安全性的生醫(yī)材料作為生物工程和臨床醫(yī)學(xué)之用。生物吸收性高分子材料應(yīng)用產(chǎn)品可運(yùn)用在外科縫合線，組織修補(bǔ)材料及藥物釋放控制等方面，配合各種藥物，營(yíng)養(yǎng)素及生長(zhǎng)激素等，在疾病的預(yù)防/治療與生物科技之應(yīng)用非常寬廣，因此非常值得投入研究與開(kāi)發(fā)。
微生物合成之聚羥基酯類(lèi)(polyhydroxyalkanoates,PHA)為一種天然生物合成高分子材料，目前主要是以 Ralstonia eutropha (以前稱(chēng)為Alcaligenes eutrophus)菌種在喜氧狀態(tài)下，以醣類(lèi)酦酵所得到的聚酯。近年來(lái)以PHA 的高分子聚合材料可用于醫(yī)學(xué)材料的研發(fā)例如drug delivery system 中的發(fā)放器(Pouton and Akhtar 1996)，另應(yīng)用有藥品、殺蟲(chóng)劑、除草劑、肥料、拋棄式物品、外科縫合材料，骨骼取代品、骨板、血管置換物。這些材料搭配各種藥物制成營(yíng)養(yǎng)素及生長(zhǎng)激素，在疾病預(yù)防治療與生物科技之應(yīng)用非常寬廣。近年來(lái)，以高分子材料配合生物醫(yī)學(xué)的研究和技術(shù)已在組織工程學(xué)(tissue engineering)上廣泛的被使用，而PHA 的研發(fā)成功將可以配合醫(yī)工的發(fā)展，這會(huì)是未來(lái)科技的趨勢(shì)。
有關(guān)哺乳動(dòng)物對(duì)植體生物兼容性的評(píng)估，主要是受體的免疫系統(tǒng)是否對(duì)植入物產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)(Graft rejection) ， 植體免疫系統(tǒng)排斥反應(yīng)主要包括非專(zhuān)一性 (non-specific)和專(zhuān)一性(specific)兩種免疫反應(yīng)。因PHB 在活體外可水解成D-(-)3-hydrobutyric acid 的單元體， 而 D-(-)-3-hydroxybutyric acid 是ketogenesis 代謝中所得到的 keto body 產(chǎn)物，此產(chǎn)物普遍存在高等動(dòng)物的身體中。近日研究數(shù)據(jù)顯示，一個(gè)100-200 單元體所組合的低分子量 P(3HB)高分子，普遍存在原核和真核細(xì)胞膜上，可作為ion channel 的基本組成(Rensch et al, 1988a ,1992)。另外，P(3HB) 的含量可在人類(lèi)的血液中偵測(cè)到，也是人類(lèi)代謝的分解產(chǎn)物之一(Rensch et al, 1992)。基于以上種種，因而推測(cè)PHB 是具有生物兼容性，可應(yīng)用在各種植體、植片、膠片等生醫(yī)材料的制作(Reusch et al, 1992)而不應(yīng)具有毒性。然而PHA 在活體的植入研究結(jié)果并不一致，首先根據(jù)活體外的方式評(píng)估 PHB 兼容性研究指出，以小鼠纖維母細(xì)胞或倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (CHO-k1)與PHB 片混合培養(yǎng)，并不會(huì)改變二種細(xì)胞生長(zhǎng)和小鼠纖維母細(xì)胞中葡萄糖消耗與乳酸的產(chǎn)生(Lafferty et al, 1988; Pouton et al, 1988)。但以PHB 和PHV 聚合物制成的導(dǎo)管植入豬的冠狀動(dòng)脈之實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PHBV 植入四周后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)炎反應(yīng)，周?chē)w維細(xì)胞增生及血管壁增厚的現(xiàn)象(van der Giessen et al, 1996)。另外以PHB 或PHB/VA 植入小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PHB 摻合Hydroxyvalerate 或Valerate 時(shí)可造成受體植入物的急性發(fā)炎反應(yīng)(Gogolewski et al, 1993)，顯示PHB 及其聚合物在生物體的兼容性仍需進(jìn)一步確認(rèn)，尤其以PHA 混合其它聚合物作摻合時(shí)，生物兼容性一定要準(zhǔn)確評(píng)估以確保PHA 的醫(yī)用安全性。
三、實(shí)驗(yàn)
1. PHA 復(fù)合物、PHA 摻合物和植入物(Implant) 準(zhǔn)備
此實(shí)驗(yàn)所需PHA 單元體與復(fù)合物將自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司并保存于desiccators 中。PHA 和PHBV 植入體約2×15 mm 盤(pán)狀或4×7 mm 之柱狀(size 將依實(shí)驗(yàn)條件做修正)先用hexane 處理去除不純之雜質(zhì)， 再以真空抽干并置于70% 酒精中作滅菌處理。
2.脾臟組織的收集和細(xì)胞懸浮液之備制
新鮮細(xì)胞懸浮液的備制根據(jù)Chou et al(1996)之方法。實(shí)驗(yàn)小白鼠先以乙醚麻醉后，由心臟抽取約1ml 血液，新鮮的脾臟由老鼠體內(nèi)取出，利用無(wú)菌的磨砂玻片將脾臟、胸腺和淋巴結(jié)制成單一細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞液于試管中靜置5 分鐘，取上清液轉(zhuǎn)入新管并離心（1500rpm，5 分鐘，4℃），保留細(xì)胞pellet 再與cold lysing buffer 作用3 分鐘以溶解紅血球，爾后以培養(yǎng)液終止紅血球溶解作用并盡速離心，清洗細(xì)胞2 次，以EtBr / AO 染色并于螢光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，最后將脾臟細(xì)胞液稀釋成5x106 cells/ml 待用。
3 . 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
本研究所使用之脾臟初代細(xì)胞和活體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要來(lái)自純系SPF（specific pathogen free）雄性BALB/c 小鼠，出生8-10 周，體重約20 克重，自國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得，動(dòng)物抵達(dá)后會(huì)被安置于一間干凈安靜的房間內(nèi)飼養(yǎng)，并有人工調(diào)控光照周期，日夜各12 小時(shí)。溫度（25℃）與濕度（60-70%）均適度監(jiān)控中，食物和飲水會(huì)按時(shí)供給與更換。動(dòng)物的操作會(huì)依照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作法來(lái)執(zhí)行。動(dòng)物的管理與飼養(yǎng)參考 Guide for care and use of laboratory（ILAR，1996）規(guī)則辦法施行。
4. PHA 生醫(yī)材料植入實(shí)驗(yàn)
將實(shí)驗(yàn)小鼠分成三組：控制組、手術(shù)控制組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組將依植入物（PHB 和PHBV）之來(lái)源與制作再細(xì)分成幾個(gè)小組，每組動(dòng)物只數(shù)為10~12 只，手術(shù)時(shí)，動(dòng)物以 70mg/kg Pento-barbital (Sigma , USA )。腹腔注射麻醉， PHB 的薄膜植入前以70%酒精浸泡2 小時(shí)，再以無(wú)菌PBS 浸潤(rùn)之后才植入手術(shù)部位，植入的皮膚先剃除毛發(fā)并以6% chlorhexidine 消毒溶液清洗，植入后傷口用含有抗生素的不沾敷料覆蓋并以彈性繃帶固定，手術(shù)后10~14 天拆除敷料，每個(gè)時(shí)段每組動(dòng)物犧牲5~6 只，取得免疫組織與PHB 植入組織做進(jìn)一步免疫功能的測(cè)定。
5. 細(xì)胞增殖活性分析（Mitogen Proliferation Assay）
自BALB/c 小鼠取得的新鮮脾臟及胸腺，各經(jīng)玻片研磨后形成單一懸浮細(xì)胞液備用。備制實(shí)驗(yàn)所需的PHB 懸浮液（0-100μg/ml）、分裂原Con A（0-6μg/ml）及LPS（0-10 μg/ml）濃度并分別與5x105 cells 脾臟免疫細(xì)胞作用共同培養(yǎng)48 小時(shí)（37℃、5%CO2）。細(xì)胞增殖的反應(yīng)結(jié)果將以MTT 測(cè)定法測(cè)定（Gerler et al., 1986），實(shí)驗(yàn)結(jié)果以%控制組細(xì)胞值表示。
6. 細(xì)胞激素含量之定量分析（Cytokine Quantitation）
樣本中IL-1、IL-6 與TNF-α 的含量主要是利用R & D system 的Duoset ELISA Development Kit 作測(cè)定，實(shí)驗(yàn)操作依kit 所提供的流程完成，如今簡(jiǎn)述如下：培養(yǎng)盤(pán)上每孔加入100 ul 已稀釋的capture antibody，室溫下培養(yǎng)2 小時(shí)，以 washing buffer 洗去未貼附的抗體，加入300ul 的blocking buffer 并于室溫下培養(yǎng)2 小時(shí)，以washing buffer 洗去殘余的溶液，加入100ul 的細(xì)胞上清液或細(xì)胞激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，室溫培養(yǎng)1 小時(shí)后亦以washing buffer 去除細(xì)胞上清液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入100ul 的biotinylated goat anti-mouse Ab，室溫培養(yǎng)2 小時(shí)，以washing buffer 洗去未貼附的抗體，再加入100ul 的streptavidin-HRP，室溫培養(yǎng)20 分鐘后去除多余的substrate，加入100ul 的substrate solution，室溫下避光培養(yǎng)15-20 分鐘，以2N H2SO4 停止反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)450nm 的吸光值。所得之吸光值對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求細(xì)胞激素的相對(duì)濃度。
7. 腫瘤壞死因子定性之測(cè)定（TNF Bio-Assay）
實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前2-3 天，將L929 細(xì)胞株由25T 培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入 75T 培養(yǎng)皿中大量培養(yǎng)，待L929 細(xì)胞株于培養(yǎng)皿中形成單層細(xì)胞后才開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第一天，收集培養(yǎng)皿中l(wèi)og 生長(zhǎng)期的細(xì)胞并離心（1500rpm，10 分鐘），將細(xì)胞稀釋成2.5x105/ml，取100μl/well 的細(xì)胞加入96 孔培養(yǎng)盤(pán)中，于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24 小時(shí)。第二天，確定培養(yǎng)盤(pán)中的細(xì)胞已形成單層細(xì)胞后，先加入10μl/well Actinomycin-D（60μg/ml）抑制L929 細(xì)胞的增殖作用，再分別將待測(cè)的細(xì)胞上清液或TNF 標(biāo)準(zhǔn)品（0-100U/ml）加入，繼續(xù)培養(yǎng)24 小時(shí)。第三天，以PBS 去除培養(yǎng)盤(pán)之上清液及未貼附的細(xì)胞，再加入50μl/well stain solution（20% formalin + 0.2% crystal violet）于室溫中作用20 分鐘，以自來(lái)水浸泡培養(yǎng)盤(pán)數(shù)次，去除多余的染液，風(fēng)干。第四天，加入100μl/well PBS/Ethanol solution（1：1）溶解細(xì)胞，測(cè)定波長(zhǎng)570nm 吸光值，所得之吸光值對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求TNF 濃度。
8. 一氧化氮濃度分析（Nitric Oxide Assay）
免疫細(xì)胞與PHB、PHBV 或分裂原培養(yǎng)后所得的上清液中內(nèi)含細(xì)胞釋放的一氧化氮，由于NO 在空氣中極不穩(wěn)定易轉(zhuǎn)變?yōu)镹itrite 與Nitrate，因此此法是測(cè)定樣本中nitrite 的含量來(lái)評(píng)估NO 之含量。Nitrite 的濃度主要是利用NaNO2 作出Nrtrite 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以取得溶液中的NO/Nitrite 相對(duì)濃度。首先2mM NaNO2 以PBS 等量稀釋成0-100μM，Griess A 及B 等量混合形成Griess reagent，操作前將100μl/well Griess reagent 與NaNO2 或上清液混合作用10 分鐘，測(cè)定波長(zhǎng)550nm 的吸光值，所得的溶液吸光值對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可決定Nitrite 的濃度（Stuehr ＆Nathan, 1989）。
四、結(jié)果與討論
生物高分子材料制成的產(chǎn)品早已被廣泛的應(yīng)用在生醫(yī)材料、醫(yī)藥品、化妝品、食品、化工原料及研究等用途上，并且有逐年增加的趨勢(shì)。高分子—PHA 是一種由微生物合成之天然高分子，在商業(yè)界早已普遍用在日常用品容器或器具之材質(zhì)，在醫(yī)學(xué)界，部分PHA 材料已結(jié)合其它生醫(yī)材料，用在長(zhǎng)期藥物的攜帶設(shè)計(jì)、藥品、外科縫合材料，骨骼取代品、骨板和血管置換物等。
生物相關(guān)性（Biocompatibility）是評(píng)估植入物與受體互動(dòng)的觀察，當(dāng)受體的細(xì)胞群感受到植入體存在時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和模式會(huì)因此植入物的材質(zhì)作條件式的調(diào)整，如果植入物的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異度較大者，會(huì)影響受體細(xì)胞的活性和正常功能的表現(xiàn)。來(lái)自新鮮組織的初代細(xì)胞不僅可真實(shí)反應(yīng)活體細(xì)胞之生理作用，對(duì)接下來(lái)活體實(shí)驗(yàn)得評(píng)估具連續(xù)性和整體性。本研究為了驗(yàn)證細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)之真實(shí)性，將取自小鼠脾臟和胸腺組織制成單一懸浮細(xì)胞，分別與高分子—PHB 或PHBV 作培養(yǎng)。研究材料是以購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 的PHB 或PHBV 進(jìn)行測(cè)試，研究結(jié)果顯示高分子—PHBV 對(duì)脾臟細(xì)胞不具毒性也不會(huì)影響增殖反應(yīng)，并且PHBV 也不會(huì)影響T 淋巴球分裂原（Con A）和B 淋巴球分裂原（LPS）對(duì)脾臟初代細(xì)胞活化增殖的作用（圖一和圖二），但PHB 卻隨濃度增加會(huì)抑制Con A 對(duì)脾臟T 淋巴球的增殖作用（圖一和圖二）。
淋巴球在抗原之存在下也會(huì)釋放NO，NO 是一種訊號(hào)分子，可作用在不同目標(biāo)細(xì)胞中，調(diào)控許多細(xì)胞死亡與增生之訊號(hào)反應(yīng)，而過(guò)高的NO 反而會(huì)抑制淋巴球之增殖作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖三B），高分子—PHBV 不會(huì)處進(jìn)促LPS 刺激脾臟B 淋巴球和巨噬細(xì)胞對(duì)NO 的產(chǎn)生。但PHB 和PHBV 卻會(huì)增加培養(yǎng)液中Con A 刺激脾臟T 淋巴球?qū)O 的產(chǎn)生（圖三）。另外，Con A 和LPS 可以引發(fā)脾臟細(xì)胞中T、B 淋巴球和吞噬細(xì)胞活化而增殖，進(jìn)而刺激其產(chǎn)生細(xì)胞激素。研究細(xì)胞激素結(jié)果顯示（圖四），在LPS 刺激下，培養(yǎng)液中加入高分子 PHB 會(huì)顯著抑制脾臟初代細(xì)胞對(duì)IL-1β、IL-6 和TNF- α的產(chǎn)生（圖四）。我們也以生物活性測(cè)驗(yàn)（Bioassay）對(duì)PHB 處理后細(xì)胞所產(chǎn)生之TNF 的活性（數(shù)據(jù)未顯示）作評(píng)估，結(jié)果顯示，高分子PHB 不僅可造成初代淋巴細(xì)胞對(duì)TNF 制作量的減少，也會(huì)影響TNF 毒殺L929 細(xì)胞的活性表現(xiàn)（圖五）。根據(jù)此研究的結(jié)果建議PHB 雖不會(huì)顯著影響分裂原活化之淋巴球的增生，但卻顯示 PHB 對(duì)T 淋巴細(xì)胞的活性會(huì)有影響。甚至可能造成細(xì)胞失去正常功能。
為了增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，加上PHB 在體內(nèi)分解須長(zhǎng)時(shí)間，因此我們須作更長(zhǎng)期的觀察，我們委托淡江大學(xué)董崇民老師將PHB 聚合物和PHBV 摻合物制作成薄膜(0.9 x 0.7x 0.02 cm 大小)，以進(jìn)行植入小鼠背部皮下實(shí)驗(yàn)；經(jīng)過(guò)六個(gè)月評(píng)估顯示PHB 和PHBV 的植入，并不會(huì)造成植入?yún)^(qū)域和鄰近組織的病變，初期3 個(gè)月在植入周?chē)邪籽蚓奂爽F(xiàn)象為短期，隨著傷口愈合，白血球聚集現(xiàn)象也隨著消失，并且植入?yún)^(qū)域皮膜和毛發(fā)生長(zhǎng)正常（圖六），此結(jié)果顯示PHB 和PHBV 生物兼容性頗高，因而未來(lái)決定進(jìn)行整體活體植入評(píng)估試驗(yàn)。
五、參考文獻(xiàn)
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