單細(xì)胞免疫印跡技術(shù)（scWestern），采用可擴(kuò)展開放式的微孔陣列凝膠芯片，通過重力作用驅(qū)動細(xì)胞沉降落孔，經(jīng)化學(xué)裂解細(xì)胞并整合SDS-PAGE電泳分離細(xì)胞裂解釋放的蛋白質(zhì)，后以短時間紫外線激發(fā)（～60s）激活光敏性凝膠，凝膠與蛋白質(zhì)交聯(lián)而固定蛋白質(zhì)固定于凝膠內(nèi)。紫外交聯(lián)替代了傳統(tǒng)western blot中繁瑣的轉(zhuǎn)膜流程，實(shí)現(xiàn)在4h內(nèi)完成單細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的表達(dá)水平分析。scWestern結(jié)合了SDS-PAGE的分子篩效應(yīng)，通過蛋白質(zhì)的分子量和抗原抗體識別雙重驗(yàn)證，保證了檢測的特異性，可檢測細(xì)胞表面蛋白、跨膜蛋白、胞內(nèi)及核內(nèi)的蛋白，可區(qū)分經(jīng)表觀遺傳修飾蛋白。單細(xì)胞免疫印跡技術(shù)可實(shí)現(xiàn)高通量、多指標(biāo)共檢，并在單細(xì)胞水平研究復(fù)雜細(xì)胞群體，在藥物篩選、細(xì)胞異質(zhì)性研究等方面具有重要的應(yīng)用價值。
單細(xì)胞免疫印跡技術(shù)的核心—光敏感性蛋白質(zhì)固定凝膠為基于二苯甲酮修飾聚丙烯酰胺凝膠BPMAC。BPMAC經(jīng)紫外激活生成的中間體半衰期較短，且可非特異性與鄰近X?H鍵（X = C, N, O, or S）反應(yīng)，故而光敏固定效率較低。凝膠內(nèi)背景噪音增加，背景熒光高，方法靈敏度低，難以應(yīng)用于低豐度蛋白質(zhì)的檢測。另外，紫外激發(fā)波長較短（UVB，280~320nm），可能引起蛋白抗原位點(diǎn)失活，造成假陰性。
近日，上海交通大學(xué)丁顯廷教授團(tuán)隊(duì)在Advanced Functional Material上發(fā)表了題為“A Photoclick Hydrogel for Enhanced Single-cell Immunoblotting”的文章。該文章報道了四唑修飾的新型光敏感性丙烯酰胺凝膠。該四唑交聯(lián)丙烯酰胺凝膠將光敏基團(tuán)與聚丙烯酰胺基團(tuán)結(jié)合，將蛋白質(zhì)分離功能和蛋白質(zhì)光敏固定功能集合，具備以下技術(shù)優(yōu)勢：1）紫外激發(fā)波譜更窄且波長更長，能量更低。避免引起蛋白抗原位點(diǎn)失活及膠內(nèi)高自發(fā)熒光背景。2）與蛋白分子的功能團(tuán)聚合速度更快，極大提高蛋白固定效率，避免因聚合速度慢，蛋白擴(kuò)散引起的靈敏度降低。3）不影響SDS-PAGE本身的分子篩效應(yīng)，保留原方法的特異性及分離分辨率。4）不影響抗原抗體結(jié)合或受體配體結(jié)合或酶活性或適配體結(jié)合等。不影響后續(xù)檢測體系的搭建。5）非選擇性。可同時非選擇性固定所有蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)ProtCOO-反應(yīng)。該凝膠的優(yōu)良性能使其在毛細(xì)管、微流控芯片原位免疫印跡分析中具有廣闊的應(yīng)用前景，為應(yīng)用單細(xì)胞免疫印跡分析技術(shù)研究低豐度蛋白的研究人員提供解決方案。
上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院個性化醫(yī)學(xué)研究院是中國最早建立起單細(xì)胞免疫印跡技術(shù)的單位之一，并已初步實(shí)現(xiàn)技術(shù)向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，先后利用單細(xì)胞痕量蛋白分析技術(shù)完成了芯片CTC富集表征、有效轉(zhuǎn)染的單細(xì)胞篩選及生物通路研究方面的相關(guān)應(yīng)用研究。
本研究由上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院丁顯廷和謝海洋課題組完成。博士生張婷、李山鶴是該論文的第一作者。丁顯廷教授和謝海洋助理研究員是論文的通訊作者。相關(guān)研究得到國際人類表型組計(jì)劃、科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、上海市教委科研項(xiàng)目等項(xiàng)目的支持。
論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.201910739
