西南大學(xué)陸飛副教授課題組在國(guó)際知名期刊《International Journal of Biological Macromolecules》上發(fā)表題為"Delivering urokinase-type plasminogen activator using mulberry leaf exosomes enables thrombolysis and remodeling of venous microenvironments"的最新研究成果
西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院陸飛副教授在化學(xué)領(lǐng)域知名期刊《International Journal of Biological Macromolecules》上發(fā)表最新研究成果。
納米醫(yī)學(xué)是納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，在診斷和治療方面已取得重大進(jìn)展。納米藥物載體具有體積小、修飾靶向、避免內(nèi)皮系統(tǒng)清除、包封多種藥物、延長(zhǎng)藥物在血液中的循環(huán)等優(yōu)點(diǎn)。新型生物材料的應(yīng)用，如脂質(zhì)納米載體、聚合物基納米平臺(tái)、超聲響應(yīng)載體和無(wú)機(jī)納米顆粒等，已經(jīng)得到了大量的研究。與其他遞送平臺(tái)相比，外泌體具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性、低免疫原性和高載藥能力等顯著優(yōu)勢(shì)，是一種很有前景的治療遞送載體。外泌體是細(xì)胞外細(xì)胞衍生的磷脂納米載體，直徑為40-150 nm。它們攜帶DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等小分子，可以將生物活性分子傳遞給特定的受體細(xì)胞。與來(lái)源于動(dòng)物的外泌體相比，從可食用植物中提取的外泌體具有許多優(yōu)勢(shì)，包括成本效益和攜帶抗炎、抗氧化和再生特性的活性成分。因此，植物來(lái)源的天然脂質(zhì)外泌體在藥物傳遞和組織再生領(lǐng)域受到了極大的關(guān)注。來(lái)自不同植物的外泌體的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成影響其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，其天然成分可能具有不同的功能。
近日，西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院陸飛副教授課題組在《International Journal of Biological Macromolecules》上發(fā)表題為"Delivering urokinase-type plasminogen activator using mulberry
leaf exosomes enables thrombolysis and remodeling of venous microenvironments"的研究成果（https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.136866）。該研究報(bào)道了一種以天然桑葉脂質(zhì)外泌體為基礎(chǔ)的納米載藥體系。成功構(gòu)建針對(duì)靜脈血栓栓塞的給藥平臺(tái)uPA/MLE@cRGD，通過(guò)靜脈注射有效清除活性氧、促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
在血栓形成的治療中，常規(guī)納米載體不可避免地存在不良反應(yīng)、合成困難等問(wèn)題。受“藥食同源”概念的啟發(fā)，我們從桑葉中提取并純化了天然外泌體，作為運(yùn)送尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）的載體，用于靶向治療。所獲得的桑葉外泌體（MLE）具有理想的流體動(dòng)力學(xué)粒徑（119.4
nm），尺寸分布均勻（多分散性指數(shù)= 0.174），表面電荷為負(fù)（- 23.3 mv）。在加載uPA之前，MLE被修飾了cRGD，以選擇性地結(jié)合活化的血小板靶向血栓。流式細(xì)胞術(shù)研究顯示MLE@cRGD具有74.3%的高血栓靶向能力。此外，MLE可以通過(guò)有效消除活性氧（ROS），促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1向M2表型轉(zhuǎn)化，從而重塑靜脈微環(huán)境，進(jìn)行靜脈組織修復(fù)。
圖1 uPA/MLE@cRGD的制備及其治療靜脈血栓栓塞的作用機(jī)制
透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）顯示，MLE納米顆粒表現(xiàn)出典型的外泌體形態(tài)，具有圓形的膨出結(jié)構(gòu)（圖2A, B）。納米顆粒跟蹤分析（NTA）結(jié)果顯示，MLE的平均粒徑為119.4 nm，粒徑分布均勻（PDI=0.173）（圖2E）。FTIR和XPS結(jié)果證實(shí)了MLE@cRGD的成功制備。
圖2 結(jié)構(gòu)表征
為了全面評(píng)估uPA/MLE@cRGD的細(xì)胞毒性，使用CCK-8法將HUVECs與納米載體共培養(yǎng)72小時(shí)。為了評(píng)估細(xì)胞活力，在24，48和72小時(shí)，使用酶標(biāo)儀在450
nm處測(cè)量吸光度。如圖3C所示，MLE, MLE@cRGD和uPA/MLE@cRGD與HUVECs共培養(yǎng)72小時(shí)后，納米載體對(duì)HUVECs沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。
圖3 生物相容性
MLE和MLE@cRGD與活化血小板在37℃共孵育30 min后，采用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估靶向效果。如圖4A，4B所示，大量MLE（綠色熒光）分散在活化血小板周圍（藍(lán)色熒光），一小部分MLE聚集在血小板周圍。靶向肽接枝后，MLE@cRGD（綠色熒光）比MLE更多地聚集在活化血小板（藍(lán)色熒光）周圍，表明MLE@cRGD具有出色的靶向能力。
圖4 體外靶向
經(jīng)尾靜脈注射Cy5.5-uPA和Cy5.5-uPA/MLE@cRGD （10 mg/kg）后，在不同時(shí)間點(diǎn)采集血清，用IVIS光譜系統(tǒng)記錄熒光強(qiáng)度。注射后30 min, uPA的熒光信號(hào)開(kāi)始消失，而uPA/MLE@cRGD的熒光密度在4 h時(shí)仍有明顯的熒光信號(hào)，這證明MLE@cRGD顯著延長(zhǎng)了uPA在血液循環(huán)中的半衰期。不同給藥組對(duì)股靜脈血栓形成的治療效果見(jiàn)圖5F。uPA/MLE@cRGD的血栓塊幾乎完全溶解，但uPA組仍有小的血栓塊未溶解，這可能是因?yàn)?/span>uPA在血液循環(huán)中代謝迅速，uPA/MLE@cRGD富集并長(zhǎng)時(shí)間停留在血栓部位，發(fā)揮了uPA的溶栓功能。
圖5 體內(nèi)溶栓
如圖6A所示，對(duì)照組的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量很少，而MLE和uPA/MLE@cRGD處理后，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加。uPA組雖然也能檢測(cè)到M2巨噬細(xì)胞的紅色熒光，但其強(qiáng)度和相對(duì)面積遠(yuǎn)低于MLE組。采用Image J軟件定量分析M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163的紅色熒光。如圖6B所示，與PBS組的0.7%相比，MLE（6.5%）和uPA/MLE@cRGD（9.5%）的熒光面積分別增加了5.7%和8.7%，表明MLE顯著促進(jìn)了巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化。
圖6 巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化
該研究為外泌體給藥提供了重要參考。促進(jìn)植物源性外泌體及其溶栓治療作用的研究從實(shí)驗(yàn)室到臨床可能還有很長(zhǎng)的路要走；然而，這個(gè)領(lǐng)域是開(kāi)放的，充滿了潛在的機(jī)會(huì)。
西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院2022級(jí)碩士研究生管鵬鵬為本文第一作者，西南大學(xué)陸飛副教授為本文的通訊作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、重慶市自然科學(xué)基金的資助。
課題組一直專注于針對(duì)創(chuàng)面止血與促愈用材料、體內(nèi)溶栓藥物載體的研究，近三年課題組成員共主持包括國(guó)防項(xiàng)目，國(guó)家自然科學(xué)基金，重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目，重慶市自然科學(xué)基金在內(nèi)的20余項(xiàng)科研項(xiàng)目。在Advanced
Functional Materials、Bioactive Materials、Chemical Engineering Journal等雜志上發(fā)表高水平SCI論文50余篇；已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利40項(xiàng)，其中已授權(quán)20余項(xiàng)。
本研究成果原文下載：
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.136866