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  纖維素的降解主要依靠細(xì)菌和真菌等微生物分泌纖維素酶完成。一般來(lái)說(shuō)，纖維素酶按照其催化功能可分為3大類：外切-β?1,4-葡聚糖酶（exo-β?1,4-glucanases/cellobiohydrolases），內(nèi)切-β?1,4-葡聚糖酶（endo-β?1,4-glucanases）和β-葡萄糖苷酶（β?1,4-glucosidases）。

  研究表明，結(jié)晶纖維素的徹底降解至少需要這3組纖維素酶的協(xié)同作用：外切酶水解纖維素的結(jié)晶區(qū)，從纖維素鏈的還原端（reducing end）或非還原端（non-reducing end）開始持續(xù)水解，釋放纖維二糖，是水解天然纖維素底物的首要條件；內(nèi)切酶主要作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解纖維素鏈中的糖苷鍵，把纖維素的長(zhǎng)鏈切斷，變成大量不同聚合度的纖維素短鏈，使得纖維素分子的聚合度降低，可供外切酶作用的纖維素鏈末端數(shù)增加；β-葡萄糖苷酶則主要水解纖維二糖和可溶性纖維寡糖，最終將纖維素轉(zhuǎn)化為可利用的葡萄糖。在這個(gè)過(guò)程中，主要的限速步驟是外切酶對(duì)結(jié)晶纖維素的水解，目前發(fā)現(xiàn)的外切酶存在數(shù)量少，效率不高的問(wèn)題。

  近年來(lái)有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)有一種內(nèi)切酶也可以作用于結(jié)晶纖維素，像外切酶一樣從結(jié)晶表面剝離出一條纖維素單鏈以后在上面持續(xù)滑動(dòng)，命名為持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶。與傳統(tǒng)外切酶的“threading（穿針）”不同，持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域是開放的裂隙，每走一步釋放一個(gè)纖維四糖。因此，雖然水解效率提高了，但是與底物的親和力不夠強(qiáng)，容易脫落，導(dǎo)致整體效率仍然無(wú)法提高。

  中科院青島能源所研究員李福利帶領(lǐng)的分子微生物工程研究組在一株嗜熱纖維素降解菌株Clostridium cellulosi CS-4-4中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)多模塊的持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶CcCel9A（Appl Environ Microbiol, 2014, 80(8): 2592-2601），該酶每滑動(dòng)一步釋放一個(gè)纖維四糖，而且含有多達(dá)5個(gè)底物結(jié)合模塊（CBM），保證了酶和底物的有效吸附，整體水解效率比之前報(bào)道提高一倍。研究組與山東大學(xué)微生物技術(shù)研究院王祿山教授及蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)研究組姚禮山研究員合作，CcCel9A的各個(gè)模塊及活性中心關(guān)鍵位點(diǎn)的功能得到解析。

  結(jié)果表明，CcCel9A中C末端的CBM3b模塊主要負(fù)責(zé)破壞結(jié)晶結(jié)構(gòu)，中間的3個(gè)CBMX2模塊協(xié)助吸附底物，而靠近催化結(jié)構(gòu)域的CBM3c模塊的功能是為活性中心提供纖維素單鏈，其表面非常平坦，相當(dāng)于把活性中心的底物結(jié)合位點(diǎn)延長(zhǎng)到13個(gè)亞位點(diǎn)。當(dāng)單鏈進(jìn)入活性中心以后，底物結(jié)合亞位點(diǎn)+1/+2利用氫鍵作用力使底物與CBM3c模塊分離，然后產(chǎn)物釋放亞位點(diǎn)-4~-1將單鏈拉動(dòng)到-4位置，催化位點(diǎn)在+1與-1之間將單鏈切斷，纖維四糖釋放（圖1）。總之，CcCel9A通過(guò)多個(gè)CBM模塊，13個(gè)底物結(jié)合亞位點(diǎn)以及大產(chǎn)物（纖維四糖）的釋放來(lái)增強(qiáng)底物和酶的相互作用，大大彌補(bǔ)了開放催化結(jié)構(gòu)域的不足。基于以上研究結(jié)果，他們提出了多模塊持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶降解結(jié)晶底物的新模式—“wirewalking （走鋼絲）”模式。

圖1 持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶CcCel9A的“走鋼絲”工作模式

  相關(guān)論文已于近日被Biomacromolecules雜志接收，張坤迪助理研究員為第一作者，李福利研究員與王祿山教授為共同通訊作者。

  該研究獲得了科技部973基礎(chǔ)研究計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金以及山東省自然科學(xué)杰出青年基金的支持。

  論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.8b00340