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  肌腱通過纖維軟骨界面(enthesis)插入骨骼，以減少機械張力和組織衰竭。盡管有這種增韌機制，但撕裂也會因為急性(超載)或降解(老化)過程而發(fā)生。而手術(shù)將撕裂的肌腱固定到骨中，會導致具有較低生物力學性能的瘢痕組織界面的形成。來自美國伊利諾大學厄巴納-香檳分校的Brendan A.C. Harley等人報道了一種創(chuàng)新的組織加固策略：包含骨性和腱性組織隔層的層狀支架，通過連續(xù)的聚乙二醇(PEG)水凝膠界面連接。調(diào)整水凝膠的凝膠動力學可以調(diào)節(jié)與側(cè)翼間室的整合，并產(chǎn)生生物力學性能優(yōu)勢。值得注意的是，在傳統(tǒng)的分層生物材料中，水凝膠界面減少了組織隔層間菌株濃度的形成，這可能會產(chǎn)生有害的生物效應。這種機械堅固的分層復合生物材料的設計可能適用于廣泛的肌腱和韌帶-骨插入。相關論文以題為“Tough and tunable scaffold-hydrogel composite biomaterial for soft-to-hard musculoskeletal tissue interfaces”發(fā)表在Science Advances上。

1.背景介紹

  尾端是一種分層的纖維軟骨組織(250-500 μm寬)，包含細胞表型、生化信號、礦物質(zhì)含量、基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)排列的梯度，從而提供一個過渡區(qū)，通過該過渡區(qū)肌腱連接到骨骼。這種獨特的界面組織微環(huán)境通過提供一個持續(xù)的高順應性的能量吸收區(qū)，促進了功能承載，這是拉伸載荷下組織增韌的一個重要機制。典型的尾端損傷是肩袖撕裂，急性超負荷、隨年齡增長的退化或兩者的結(jié)合導致肌腱到骨骼的局部或全寬度撕裂。肌腱再附著是臨床標準，但會導致狹窄的纖維血管瘢痕組織的形成，而不是一個梯度的纖維軟骨結(jié)束。在機械不匹配的肌腱和骨骼之間形成的銳邊界導致了應變濃度，這大大增加了再次失敗的風險(在一些老年人口中為90%)。撕裂組織的功能性恢復需要纖維軟骨順應性界面的再生；然而，由于缺乏能夠滿足這些組織獨特功能需求的生物材料設計，再生修復策略的進展受到阻礙。

  分層生物材料為尾端的修復提供了潛在的優(yōu)勢。這些生物材料可以選擇性地呈現(xiàn)具有成分、結(jié)構(gòu)和力學特征的優(yōu)化信號模式，這些特征在離散區(qū)域內(nèi)定制，以在空間上調(diào)節(jié)細胞生物活性和組織重塑。為此，研究者最近描述了一種凍干方法來制造含有腱(各向異性)和骨(礦化)腔室的雙相膠原支架，這些腔室具有不同的組成和結(jié)構(gòu)，通過連續(xù)的界面連接。然而，這種雙相支架和大多數(shù)用于肌腱-骨結(jié)合修復的生物材料將肌腱-骨結(jié)合復制為肌腱和骨之間的梯度過渡，而不是一個獨特的多尺度組織。雖然在肌腱和骨修復的生物材料已經(jīng)取得了顯著的進展，但在生物材料中組織間的固有力學不匹配，可能在生物學和力學上對肌腱的修復是有害的。肌肉負荷是肌腱、骨和肌腱的發(fā)育和維持所必需的，也是損傷和修復后不可避免的。在這項研究中，研究者表明，在承受力矩驅(qū)動的拉伸載荷時，人類的肩膀在肌腱-骨骼插入處有可能產(chǎn)生大量的應變濃度，這一特性取決于肩膀的整體剛度。在受載的分層充填生物材料中，在不同的腱和骨區(qū)域之間的界面上的力學不匹配同樣會導致應變集中，這會大大降低細胞存活率并成為可能的骨折點。因此，由此產(chǎn)生的界面應變導致細胞反應減弱，在需要再生的精確位置導致移植物失敗。

  在這里，研究者報告了一種獨特的生物材料增強基序的發(fā)展和驗證，其靈感來自于原生尾端的結(jié)構(gòu)-功能特性：在力學上不匹配的腱組織和骨組織間包含一個兼容的水凝膠界面。雖然這些設計元素在工程材料中很常見，但在組織工程生物材料中還沒有被探索過。研究者已經(jīng)開發(fā)了一種方法來控制在腱和骨間的柔性聚乙二醇(PEG)水凝膠帶的插入和穩(wěn)定之前描述的雙相膠原支架。由此產(chǎn)生的三相生物材料不同于缺乏連續(xù)界面的分層兩相或三相生物材料。研究表明，調(diào)整該水凝膠區(qū)制造參數(shù)提供了一種穩(wěn)健的方法，以降低在雙材料界面不匹配時形成的應變濃度水平。水凝膠嵌入也顯著提高了整個組織支架的宏觀力學性能，并為組織工程方法提供了一種新的設計范式，以改善廣泛的肌肉骨骼組織插入的愈合。

2.材料與方法

2.1 水凝膠穩(wěn)定地集成不同的組織支架隔層

  研究者使用辣根過氧化物酶介導的化學聚合，將四臂PEG-硫醇單體共價交聯(lián)到界面水凝膠網(wǎng)絡中(圖1A)。這里，t_cross定義的是從主要粘性(G′ < G′′)到彈性(G′ > G′′)材料的轉(zhuǎn)換時間，而平衡存儲模量(G′_eq)是材料彈性響應的量度。研究者從之前鑒定過的凝膠庫中選擇了一組PEG-SH水凝膠，以匹配凍干支架制造的時間范圍(t：0~60分鐘)，并具有一系列彈性行為(G′_eq: 4 to 15 kPa)(表1)。

表1 以前報告的SAOS測量中識別的水凝膠樣品一系列的測試集參數(shù)t_cross, Δt_gel和G′_eq。 

圖1 PEG水凝膠的交聯(lián)反應與三相支架的制備。

  為了制造連續(xù)的三相支架，研究者采用了一種銅聚四氟乙烯(PFTE)模具，該模具允許水平裝載液體懸浮液，以便在凍干之前進行精確的分層和控制相擴散(圖1B)。經(jīng)凍干后，在結(jié)構(gòu)上形成了連接腱和骨支架間的PEG水凝膠界面層的連續(xù)三相支架(圖1C)。在模具一端，銅和PFTE之間的導熱系數(shù)不匹配建立了局部定向凝固，誘導形成各向異性的非礦化(腱狀)支架腔，而在模具另一端，形成了各向同性礦化(骨)膠原支架結(jié)構(gòu)。

2.2 界面水凝膠的整合和拓撲結(jié)構(gòu)取決于凝膠動力學

  環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)的三相支架圖像表明，可以通過改變水凝膠的凝膠化性能來調(diào)整水凝膠界面的拓撲結(jié)構(gòu)和摻入程度。總體而言，凝膠化速度快的水凝膠(快的t_cross和短的Δt_gel)更均勻地以明顯的單片水凝膠層混入支架中，而凝膠化速度慢的水凝膠則分布在兩側(cè)組織隔室的膠原纖維中(圖2A)，可能是由于水凝膠和膠原懸浮液之間擴展的擴散混合。支架與水凝膠界面的寬度也可以通過凝膠化來控制(圖2B)，從而可以根據(jù)不同的水凝膠化特性制備具有獨特界面區(qū)的三相支架。水凝膠界面分為快速(3~4分鐘)、中等(6分鐘)和慢速(12分鐘) t_cross；短(7-9分鐘)或長(31-51分鐘)Δt_gel; 以及低(1-5 kPa)或高(10-15 kPa) G′_eq。在這里，三相支架是通過這些獨特的凝膠化參數(shù)(t_cross:Δt_gel:G′_eq)來識別的，這些參數(shù)描述了從粘彈性轉(zhuǎn)變的時間(t_cross)，完成凝膠化的時間(Δt_gel)，以及水凝膠界面的最終彈性特性(G′_eq)。

圖2 界面水凝膠的拓撲結(jié)構(gòu)和寬度。

2.3 界面水凝膠可以調(diào)節(jié)支架對拉伸載荷的響應

  研究表明，在單軸拉伸條件下，凝膠依賴于摻入柔性水凝膠層是一種有效的骨架增韌機制。與缺乏水凝膠插入的雙相支架相比，含有快速凝膠(t_cross)水凝膠配方(快速:長:高、快速:慢:低)的三相支架的大塊支架韌性顯著提高(圖3A)。韌性似乎不受總凝膠化時間 (Δt_gel) 或水凝膠相彈性性能(G′_eq)的強烈影響。快速膠凝合成的變體也比其他慢 t_cross 交聯(lián)的變體顯示出明顯更高的韌性，這表明在該制造方案中，需要一個特定的凝膠時間尺度納入到增韌界面水凝膠中。

  快速t_cross水凝膠增加韌性的機理是不同的(圖3B)。水凝膠長的Δt_gel和高G′_eq顯著提高了極限抗拉強度(圖3C)和三相的支架的彈性模量(圖3E)，從而形成了更高的應力-應變曲線以及最大承受應力也隨之增加。相對地，具有短的Δt_gel和低的G′_eq(快：短：低)的水凝膠顯著增加了骨折前的應變耐受性(圖3D)，彈性模量明顯降低，從而形成更具延展性的三相支架。這些不同的增韌機制在應用生理壓力下是顯而易見的(圖3F-G)。在最大施加應變?yōu)?%時，由于相對較低的壓力級別，更加延展快：短：低的變體比更高剛度快：長：高的變體明顯表現(xiàn)出較低的柔韌性。

圖3 塊狀支架在單軸拉伸下的力學性能。

2.4 水凝膠可以消除力學上完全不同組織隔層之間的界面張力

  為了便于實驗組之間的比較(圖4)，所有支架的應變分布均使用相同的標度進行報道，并使用個性化標度來更準確地顯示實驗組內(nèi)的應變。在3.3%的塊狀實施應變下，雙相支架在腱組織和骨性組織間的界面處出現(xiàn)了一個巨大的應變(~10%)，這是最終在3.5%的塊狀實施應變下的斷裂點(圖4A)。與雙相支架相比，三相支架沒有顯著增加韌性，在生物材料界面上顯示出相似的應變濃度。然而，高韌性的三相變體在界面處顯示出明顯的應變降低，而在彈性更強的腱區(qū)則顯示出明顯的應變升高，在那里它們最終在8.7和7.4%的施放應變下斷裂。隨后，研究者僅在腱組織和骨組織間的過渡區(qū)檢查了應變剖面，獲得了更清晰的界面應變表征(圖4B)。在3.3%的體應變作用下，兩相支架界面出現(xiàn)了比整體應變大7.2%的急劇應變濃度，而高韌性的三相支架界面出現(xiàn)了均勻分布的應變(~2%)，小于整體的體應變作用。此外，三相支架在橫向上的界面應變變異性比雙相支架低，說明界面水凝膠在其寬度上具有更均勻的應變。

圖4 在單軸拉伸下，支架的局部應變分布

2.5 人的肩膀在局部組織應變中表現(xiàn)出僵硬依賴的變化

  研究者檢查了尸體捐獻者岡上肌腱和肩包膜的應變分布。岡上肌腱被固定在一個測試儀器上，并施加扭矩載荷，導致在局部組織水平上的肌腱到骨骼的拉力載荷。在一個高剛度的試樣中，拉伸加載導致接近尾聲的應變集中可以忽略不計。然而，在較低剛度的試樣中，拉伸加載導致約14%的應變集中在尾端或靠近尾端。

4.結(jié)論與展望

  在此，研究者演示了一種以前未確認的堅韌的、分層的生物材料，用于修復尾端創(chuàng)傷的制造和驗證。在不同的膠原蛋白支架之間加入一個順從的水凝膠界面，提供了一種生物激發(fā)增強方法，以有效地分散不同生物材料環(huán)境之間的局部應變，并減少界面失效的發(fā)生。這個堅韌復合生物材料的模型可以為分層復合材料的生物激發(fā)增韌和一系列骨科插入損傷的堅固組織支架的設計提供新見解。

  參考文獻：Sun Han Chang et al., Sci. Adv. 2020; 6 DOI:10.1126/sciadv.abb6763

  原文鏈接：https://advances.sciencemag.org/content/6/34/eabb6763

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