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  醫(yī)用生物材料逐漸成為我國(guó)高速發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)和國(guó)家的重大戰(zhàn)略需求之一。為了賦予醫(yī)用生物材料材料良好的生物相容性，最常見(jiàn)的方法就是在材料表面修飾能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白/多肽。1984年，Erkki Ruoslahti和Michael D. Pierschbacher首次報(bào)道僅有三個(gè)氨基酸序列的RGD多肽能夠支持細(xì)胞粘附（Nature 1984, 309, 30–33）；這一發(fā)現(xiàn)顛覆了科學(xué)界對(duì)這一領(lǐng)域的認(rèn)知，RGD開(kāi)始被廣泛應(yīng)用于各類組織工程領(lǐng)域，并且被譽(yù)為細(xì)胞粘附多肽的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。但是，這些天然蛋白/多肽在生物體內(nèi)容易被酶降解，且價(jià)格昂貴、難以大量生產(chǎn)，這極大的限制了它們的實(shí)際應(yīng)用。因此，研究能夠替代天然蛋白/多肽的新一代細(xì)胞粘附材料對(duì)組織修復(fù)領(lǐng)域具有重要意義。

  針對(duì)這一迫切需要，華東理工大學(xué)劉潤(rùn)輝教授課題組結(jié)合RGD多肽和成骨細(xì)胞選擇性粘附多肽KRSR的結(jié)構(gòu)特征及粘附機(jī)理，以骨修復(fù)為研究模型，設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)了具有優(yōu)異細(xì)胞粘附功能的β-氨基酸聚合物。該工作以2019年10月1日劉潤(rùn)輝教授課題組發(fā)表的優(yōu)化活性表面修飾方法（J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 16772-16780）為研究基礎(chǔ)，通過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn)促成骨細(xì)胞粘附功能最佳的β-氨基酸聚合物（DM₅₀CO₅₀）（圖1），解析了細(xì)胞粘附機(jī)理，并進(jìn)一步研究了這類新材料在動(dòng)物體內(nèi)的骨修復(fù)效果。這一研究成果以題為“Dual mechanism β-amino acid polymers promoting cell adhesion”發(fā)表在Nature Communication上。

圖1. β-氨基酸聚合物的合成及高通量篩選

  通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察到細(xì)胞粘附3小時(shí)后，DM₅₀CO₅₀表面的細(xì)胞鋪展情況與KRSR表面類似；24小時(shí)后，DM₅₀CO₅₀表面與RGD表面相當(dāng)，優(yōu)于KRSR表面。這提示了聚合物粘附的機(jī)理可能與RGD和KRSR多肽不同（圖2）。

圖2. 成骨細(xì)胞在聚合物表面上的粘附和增殖

  因此作者運(yùn)用RNA-seq深入全面的分析了成骨細(xì)胞在DM₅₀CO₅₀表面和RGD表面上粘附2天后的基因差異。GO富集分析和KEGG富集分析的結(jié)果指出，聚合物DM₅₀CO₅₀粘附成骨細(xì)胞的機(jī)理與細(xì)胞膜上的整合素結(jié)合及多糖結(jié)合的通路有關(guān)（圖3）。

圖3. 成骨細(xì)胞在聚合物表面上的粘附兩天后的RNA-seq分析

  根據(jù)RNA-seq的分析結(jié)果，作者首先研究了成骨細(xì)胞在聚合物表面生長(zhǎng)2天后，表面吸附的幾種常見(jiàn)細(xì)胞粘附蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)聚合物表面的纖連蛋白和膠原蛋白含量較高，這與RNA-seq結(jié)果相互印證。同時(shí)，作者在有/無(wú)血清培養(yǎng)的環(huán)境下，用EDTA抑制劑阻斷了整合素-配體結(jié)合的細(xì)胞粘附通路。作者發(fā)現(xiàn)在有血清培養(yǎng)的情況下加入EDTA后，聚合物表面的細(xì)胞粘附鋪展面積減小但仍然能夠粘附，說(shuō)明聚合物粘附細(xì)胞的機(jī)理中有一部分來(lái)自于與整合素的相互作用，這得益于血清環(huán)境下聚合物表面上吸附的細(xì)胞粘附蛋白。與此同時(shí)，在無(wú)血清環(huán)境下加入EDTA后，聚合物表面的細(xì)胞粘附效果變化不大，這進(jìn)一步說(shuō)明聚合物粘附細(xì)胞的機(jī)理還包括除整合素以外的其他作用方式。進(jìn)一步地，作者在無(wú)血清培養(yǎng)的條件下用肝素酶和透明質(zhì)酸酶處理細(xì)胞表面，發(fā)現(xiàn)去除細(xì)胞膜表面上的多糖后，細(xì)胞粘附效果有所減弱（圖4）。

  以上研究結(jié)果表明，β-氨基酸聚合物促進(jìn)成骨細(xì)胞粘附的機(jī)理是RGD類似的整合素-配體作用以及KRSR類似的多糖作用的“雙機(jī)理”。

圖4. 成骨細(xì)胞在聚合物表面上粘附的機(jī)理研究

  最后，作者以生物惰性的PEG水凝膠作為基底，用DM₅₀CO₅₀修飾PEG水凝膠，通過(guò)大鼠顱骨缺損模型來(lái)展示聚合物在動(dòng)物體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞粘附及骨修復(fù)效果。經(jīng)過(guò)8周的修復(fù)，Micro-CT和H&E切片染色的結(jié)果顯示，DM₅₀CO₅₀修飾的PEG水凝膠骨修復(fù)效果顯著優(yōu)于未修飾的PEG水凝膠，同時(shí)也優(yōu)于商用的GelMA（甲基丙烯�；髂z）和PLA（聚乳酸）骨修復(fù)材料（圖5）。

圖5. 體內(nèi)顱骨修復(fù)效果展示

  華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院博士研究生陳琦是該成果的第一作者，華東理工大學(xué)劉潤(rùn)輝教授是通訊作者。該成果得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部等基金的資助。陳琦同學(xué)得到華東理工大學(xué)“張江樹(shù)優(yōu)博重點(diǎn)培育計(jì)劃”的資助。

  論文鏈接: https://www.nature.com/articles/s41467-020-20858-x