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  因先天性薄弱、外傷、腫瘤術(shù)后導(dǎo)致的腹壁缺損是近年來常見的外科臨床問題。腹壁缺損可能導(dǎo)致疝氣的發(fā)生，致使腸梗阻甚至于腸壞死，進(jìn)而危及生命。目前，外科手術(shù)為治療腹壁缺損的金標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)的直接縫合方法因極高的復(fù)發(fā)率被無張力補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)而替代。普外科醫(yī)生通常使用永久性聚合物網(wǎng)片[如聚丙烯網(wǎng)片(PP)]來加固缺損區(qū)域。然而，這種網(wǎng)片會(huì)誘發(fā)明顯的異物反應(yīng)并導(dǎo)致組織纖維化，可能會(huì)導(dǎo)致慢性疼痛并在術(shù)后進(jìn)一步限制患者正常運(yùn)動(dòng)。此外，傳統(tǒng)補(bǔ)片不具有粘附性，需要絲線固定，延長(zhǎng)了手術(shù)操作時(shí)間，加大暴露風(fēng)險(xiǎn)。由于修補(bǔ)材料不可吸收，會(huì)導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，包括腸糜爛和患者體力活動(dòng)受限等。此外，使用生物補(bǔ)片如豬小腸粘膜和真皮是修復(fù)腹壁缺損的替代策略。但是，生物補(bǔ)片的應(yīng)用仍然受到其過程復(fù)雜、強(qiáng)度低和成本高的限制。因此，亟需開發(fā)一種使用方便、微創(chuàng)治療、仿生、濕態(tài)下高粘附、良好機(jī)械性能、抗菌和促進(jìn)組織修復(fù)的生物多功能補(bǔ)片用于腹壁缺損修復(fù)。

  針對(duì)上述臨床問題和需求，青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院周祺惠特聘教授團(tuán)隊(duì)/附屬醫(yī)院普外科盧云主任團(tuán)隊(duì)基于席夫堿反應(yīng)開發(fā)了一種生物多功能羧甲基殼聚糖（CMCS）和四臂聚（乙二醇）醛（4-arm-PEG-CHO）水凝膠補(bǔ)片用于全層腹壁缺損修復(fù)。所設(shè)計(jì)和制備的水凝膠表現(xiàn)出優(yōu)異的自愈性和機(jī)械性能，在濕態(tài)下具有高粘附力，以及顯著的抗菌能力。另外，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，所制備的水凝膠加載重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rb-bFGF）后可以顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)而加快了大鼠模型中全層腹壁缺損修復(fù)。組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，與臨床常用的商品化PP補(bǔ)片相比，所開發(fā)的水凝膠補(bǔ)片能夠通過上調(diào) Ki67的產(chǎn)生促進(jìn)腹壁組織的修復(fù)和增厚，誘導(dǎo)膠原蛋白和新生血管形成，同時(shí)可以通過減少IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)來抑制炎癥。這些結(jié)果表明，這種新型生物多功能水凝膠補(bǔ)片在治療全層腹壁缺損方面具有巨大潛力。

圖1. 生物多功能水凝膠補(bǔ)片的制備及其在全層腹壁缺損修復(fù)中的應(yīng)用。

  如圖2（A）所示，¹H核磁光譜結(jié)果表明存在醛基(10.04 ppm)、苯環(huán)(8.14–8.16、7.88–7.90 ppm)和酯基(4.45 ppm) 質(zhì)子的峰，表明成功合成出4-arm-PEG-CHO。如圖2（B）的紅外光譜結(jié)果所示，4-arm-PEG-CHO 中1703和1723 cm^-1處的峰歸屬于–C=O ，這進(jìn)一步表明–CHO 的成功引入。水凝膠中1713 cm^-1處的峰證實(shí)了CMCS的氨基與4-arm-PEG-CHO的醛基之間發(fā)生席夫堿。為了研究不同組分比例的水凝膠的成膠特性，他們配置了三種不同比例的水凝膠(4-arm-PEG-CHO/CMCS重量比為 4:1、2:1 和 8:7，分別對(duì)應(yīng)命名為凝膠1、2和3)。由于外科醫(yī)生在手術(shù)過程中需要時(shí)間來微調(diào)補(bǔ)片覆蓋的區(qū)域，所以3–5分鐘是最適合的成膠時(shí)間。如圖2（C）/（D） 所示，不同組分比例的水凝膠室溫下成膠時(shí)間滿足上述要求。

圖2. (A) 4-arm-PEG-CHO的¹H核磁光譜圖。(B) CMCS、4-arm-PEG-CHO和水凝膠的紅外光譜圖。(C) CMCS 溶液、用紅色顏料染色的4-arm-PEG-CHO溶液和所形成的水凝膠照片。(D) 凝膠1、2和3的成膠時(shí)間。

  用于腹壁缺損修復(fù)的水凝膠應(yīng)具有較強(qiáng)的濕態(tài)下組織粘附力，能夠長(zhǎng)時(shí)間黏附于腹壁上并承受腹內(nèi)壓力。如圖3所示，凝膠1、2和3的平均爆裂壓力分別為217.5、150.0和90.0 mmHg，顯著高于正常腹內(nèi)壓（5 mmHg），甚至高于IV級(jí)腹腔筋膜室綜合癥的壓力（25 mmHg）。水凝膠1和2還可以滿足因咳嗽、打噴嚏等引起的腹內(nèi)壓快速升高這一情況的要求。另外，在模擬體內(nèi)生理環(huán)境下，6天后水凝膠對(duì)濕潤(rùn)皮膚仍表現(xiàn)出良好的粘附性能，可以有效防止水凝膠在手術(shù)后移位。體外剪切黏附試驗(yàn)可以檢測(cè)腹壁缺損修復(fù)術(shù)后因粘附性不足引起補(bǔ)片脫落。在體外搭接剪切試驗(yàn)中，如圖 3（D） 所示，水凝膠2緊密粘附在兩片豬皮上，并能承受了200 g的負(fù)荷。

圖3. (A) 凝膠1–3的平均爆破壓力。(B) 爆破壓力測(cè)試示意圖。(C) 剪切黏附試驗(yàn)示意圖。(D) 凝膠2在豬皮上的剪切黏附力（重量 = 200 克）的照片。(E) 凝膠 1–3 的平均剪切黏附力。

  為了評(píng)估水凝膠的自愈能力，他們分別進(jìn)行了宏觀自愈觀察和流變自愈測(cè)試。如圖4（A）所示，沒有任何外部刺激的情況下，被切割后的水凝膠再次愈合成完整的蝴蝶形水凝膠，并且自愈合后的水凝膠強(qiáng)度足以支撐自身重量。為了進(jìn)一步評(píng)估水凝膠的自修復(fù)特性，基于10 rad/s的角頻率進(jìn)行流變恢復(fù)測(cè)試。當(dāng)應(yīng)力加大到（γ=200%）時(shí)水凝膠的G''從37 kPa急降到3.7 kPa，并且G" > G''，表明水凝膠網(wǎng)絡(luò)已被破壞，應(yīng)力恢復(fù)到初始狀態(tài)后，G''和G"立即恢復(fù)了原始值。經(jīng)過多次循環(huán)后，G''沒有顯著下降（圖 4（C））。這種水凝膠的自愈作用主要取決于水凝膠中動(dòng)態(tài)官能團(tuán)之間的動(dòng)態(tài)反應(yīng)。在臨床上的應(yīng)用意義為：如果患者術(shù)后切口受損，補(bǔ)片發(fā)生破裂，水凝膠可自愈合，有效防止復(fù)發(fā)。

圖4. (A) 蝴蝶形水凝膠宏觀自愈的照片。(B) 應(yīng)變幅度掃描(γ=1–1000%)在固定角頻率(10 rad/s)下水凝膠2的G'' 和 G"。(C) 以 1 和 200% 的應(yīng)力下進(jìn)行流變恢復(fù)測(cè)試。

  一般來說，無張力腹壁缺損修補(bǔ)手術(shù)會(huì)存在不可避免的感染風(fēng)險(xiǎn)，因此水凝膠補(bǔ)片除了作為物理屏障外，還應(yīng)具有一定的抗菌特性。在體外抗菌測(cè)定中，采用菌落法（CFU）來研究水凝膠對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。圖5（A）顯示所有水凝膠均對(duì)兩種細(xì)菌顯示出一定的抗菌作用。為了更好地了解不同樣品的抗菌活性，通過細(xì)菌菌落數(shù)來計(jì)算抑菌率。如圖5（B）/（C）所示，隨著水凝膠中CMCS比例的增加，抗菌活性增強(qiáng)�？赡苡捎贑MCS同帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面結(jié)合，擾亂細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)成分泄漏而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。此外，動(dòng)態(tài)希夫堿在水凝膠中起著重要的抗菌作用�？傮w而言，這種水凝膠具有一定的抗菌活性，用作腹壁缺損補(bǔ)片時(shí)可以減少細(xì)菌感染的發(fā)生。另外，具有止血功能的水凝膠可以減少手術(shù)中電凝的使用，有利于組織修復(fù)和新生血管的形成。為了證實(shí)水凝膠的止血效果，他們以使用肝素化的小鼠全血為模型，測(cè)量了水凝膠的血液凝固效果。當(dāng)分別與4-arm-PEG-CHO和CMCS混合后，血液沒有凝固。而當(dāng)全血與水凝膠混合時(shí)，水凝膠可以有效地封閉血液，在PBS中浸沒30分鐘后，水凝膠中仍然沒有血性物質(zhì)滲出。血液的凝膠化主要?dú)w因于苯甲醛和氨基之間的席夫堿反應(yīng)，以及水凝膠的溶脹作用。

圖5. (A) 與水凝膠共培養(yǎng)后瓊脂板上存活細(xì)菌菌落的照片。(B, C) 水凝膠對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率。(D) 水凝膠的止血效果圖片。

  為了加速組織修復(fù)，rb-bFGF被引入到水凝膠中。他們分別將添加和未添加rb-bFGF 的水凝膠與人成纖維細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。如圖6（A）所示，所有樣品中的人成纖維細(xì)胞具有典型的紡錘形貌以及相似的細(xì)胞數(shù)量。此外，他們還進(jìn)行了活死細(xì)胞染色以評(píng)估水凝膠的細(xì)胞毒性（圖 6（B）/（C））。結(jié)果表明，水凝膠與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)1天后，各組細(xì)胞存活率均大于99%，所有組之間沒有顯著差異。如圖6（D）所示，第 1、3和5天的 CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，添加rb-bFGF的水凝膠組在第三天時(shí)細(xì)胞數(shù)量顯著增加，并在第5天仍保持增加的趨勢(shì)。所有這些結(jié)果表明，該水凝膠作為腹壁缺損補(bǔ)片具有優(yōu)異的細(xì)胞相容性。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)被用來研究水凝膠對(duì)細(xì)胞遷移的影響 (圖6（E）)。細(xì)胞被孵育 24 小時(shí)后，凝膠2+rb-bFGF組實(shí)現(xiàn)了最快的劃痕閉合（細(xì)胞覆蓋面積的 89.5%）。凝膠1–3和對(duì)照組之間沒有顯著差異。綜上所述，凝膠2 + rb-bFGF 樣品顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，顯示出對(duì)腹壁缺損修復(fù)的巨大潛力。

圖 6. (A) 人成纖維細(xì)胞與水凝膠1–3共培養(yǎng) 24 小時(shí)的熒光圖像。紅色表示通過 TRITC-鬼筆環(huán)肽染色的肌動(dòng)蛋白，藍(lán)色表示通過DAPI染色的細(xì)胞核。(B, C) 人成纖維細(xì)胞與水凝膠共培養(yǎng) 24 小時(shí)后的活/死染色熒光圖像和定量分析。紅色熒光代表死細(xì)胞，綠色代表活細(xì)胞。(D) 水凝膠與成纖維細(xì)胞孵育 1、3 和 5 天后的細(xì)胞增殖情況。(E) 劃痕處理后0、2、6、12和24小時(shí)各組細(xì)胞覆蓋占比。

  大鼠腹壁缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)被用來評(píng)估水凝膠在體內(nèi)條件下的腹壁修補(bǔ)能力。如圖7（A）所示，術(shù)后14、30和120 天，添加了rb-bFGF的凝膠2組和陽性對(duì)照組（PP網(wǎng)）均未觀察到動(dòng)物死亡或疝氣發(fā)生。14天時(shí)，在水凝膠補(bǔ)片組觀察到纖維結(jié)締組織生長(zhǎng)、新生血管形成和腹壁組織邊界消失。30天時(shí)，原有腹部缺損處充滿纖維結(jié)締組織，組織內(nèi)可見新生血管。120天時(shí)，再生組織的厚度與正常腹壁的厚度幾乎相同。在 PP 網(wǎng)片組中，各個(gè)時(shí)間段均存在有不同程度的炎癥反應(yīng)，同時(shí)腹壁和皮膚之間有大量的組織粘連。此外，與PP補(bǔ)片組相比，水凝膠組在手術(shù)過程中無需進(jìn)一步固定，大大縮短了手術(shù)時(shí)間，避免了絲固定所造成的組織損傷。

  如圖 7 （C）/（D） ，手術(shù)部位的組織病理學(xué)檢查顯示出水凝膠組有良好的組織相容性、無明顯炎癥反應(yīng)和促進(jìn)血管生成的能力。PP組周圍組織的炎癥在實(shí)驗(yàn)過程中持續(xù)存在。炎癥細(xì)胞主要聚集在PP細(xì)絲表面，存在慢性炎癥。新生血管的形成是評(píng)價(jià)修復(fù)效果的重要指標(biāo)，如圖 8（B） 所示，在第14、30和120天，水凝膠組的血管數(shù)量明顯高于PP組。Masson染色膠原沉積（圖7（E）/（F））實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PP組相比，水凝膠修復(fù)的腹壁缺損處形成了更多膠原蛋白。

圖 7. (A) 大鼠全層腹壁缺損模型示意圖。(B) 在第 0、14、30 和 120 天用添加 rb-bFGF 的水凝膠 2 和 PP補(bǔ)片處理后的腹壁組織照片。(C) 在第 14、30和120天，PP和Gel 2+rb-bFGF組的H&E 染色分析。紅色箭頭表示新生血管。(D) 第 14、30 和 120 天新生血管的定量分析。(E) 第 14、30 和 120 天腹壁缺損的 Masson染色圖像。藍(lán)色區(qū)域表示腹壁缺損處新沉積的膠原纖維。(F) 膠原形成的定量分析。

  最后，通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)IL-6、IL-1β 和 TNF-α等在慢性炎癥、自身免疫和傳染病中發(fā)揮重要作用的炎癥因子以評(píng)估腹壁缺損修復(fù)中的炎癥反應(yīng)（圖 8（A）/（B））。結(jié)果顯示，PP組IL-6、IL-1β和TNF-α陽性細(xì)胞密度明顯高于Gel 2+rb-bFGF組，進(jìn)一步證實(shí)了水凝膠組的抗炎活性。此外，如圖 8（C）/（D）所示，在第 14 天，使用添加 rb-bFGF 的 Gel 2補(bǔ)片治療的腹壁缺損處Ki67表達(dá)量明顯高于PP組。第30天和第120天兩組Ki67表達(dá)無顯著差異，這一結(jié)果可能是由于加載rb-bFGF的水凝膠在早期已釋放完全。綜上所述，與傳統(tǒng)的PP補(bǔ)片相比，加載生長(zhǎng)因子的水凝膠補(bǔ)片可以通過下調(diào)IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)來減少慢性炎癥的發(fā)生。早期通過對(duì)rb-bFGF的緩慢釋放，增加Ki67的表達(dá)，進(jìn)而顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖 8. (A, B) IL-6 和 (C, D) Ki67 在第 14、30和120天的免疫組織化學(xué)染色和定量數(shù)據(jù)。

  以上相關(guān)工作以“Bio-Multifunctional Hydrogel Patches for Repairing Full-Thickness Abdominal Wall Defect”為題，發(fā)表在《Advanced Functional Materials》雜志上(DOI: 10.1002/adfm.202105614)。本文第一作者為青島大學(xué)碩士研究生尹祥意和共同第一作者為博士后郝源萍，通訊作者為青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院周祺惠特聘教授和附屬醫(yī)院胃腸外科副主任醫(yī)師胡繼霖。

  該工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金（No. 31900957），山東省自然科學(xué)基金（No. ZR2019QC007）和山東省高等學(xué)校青創(chuàng)科技計(jì)劃（No. 2019KJE015）的支持。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202105614

  另外，周祺惠特聘教授在“（干）細(xì)胞與生物材料界面相互作用”和“新型生物醫(yī)用材料的設(shè)計(jì)、制備及其在生物醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用”等方面發(fā)表研究論文多篇：(1) Chemical Reviews 2021, 121: 4561；(2) Science Advances 2020, 6: eaay2756；(3) Journal of Nanobiotechnology 2021, 19:216；(4) ACS Applied Materials & Interfaces 2021, 13: 17289; (5) Carbohydrate Polymers 2021, 10.1016/j.carbpol.2021.118493; (6) Materials & Design 2020, 193: 108863; (7) International Journal of Biological Macromolecules 2021, 180: 599等。更多信息詳見周祺惠特聘教授課題組網(wǎng)站：https://www.x-mol.com/groups/BMTMers，課題組微信公眾號(hào)：“生物材料與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)課題組”。