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  先天性缺陷、外傷、腫瘤、原發(fā)性肌病、代謝性疾病等各種原因造成的骨骼肌缺損和功能喪失是臨床常見的病例。傳統(tǒng)治療方法主要是肌皮瓣移植，但由于可利用的自體肌肉來源有限，對(duì)供區(qū)損傷較大給病人帶來新傷害；而異體移植供體同樣面臨來源有限，且存在免疫排斥等問題，使其應(yīng)用受到限制。組織工程方法是將體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的高濃度功能相關(guān)組織細(xì)胞種植在一種生物相容性好、同時(shí)能夠被機(jī)體降解的生物材料上，即組織工程支架材料，形成材料-細(xì)胞復(fù)合物，將此復(fù)合物移植到所需部位，在機(jī)體內(nèi)細(xì)胞繼續(xù)增殖，而支架材料逐漸被降解、吸收，從而達(dá)到修復(fù)受損組織或重建功能的目的。基于組織工程方法體外構(gòu)建血管化肌肉微組織，有望解決骨骼肌組織缺損和功能喪失等問題。

  華僑大學(xué)陳愛政教授課題組和哈佛醫(yī)學(xué)院Y. Shrike Zhang教授課題組基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）多孔微球及聚乙二醇（PEG）中空短棒狀微纖維，分別通過成肌細(xì)胞（C2C12）與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的負(fù)載成功構(gòu)建血管化肌肉微組織，并通過共同注射的方式研究該肌肉微組織在血管化肌組織原位方面的應(yīng)用（圖1）。

圖1. 研究示意圖。

  首先，利用微流控技術(shù)制備了PLGA大多孔微球（PLGA PMs）并體外構(gòu)建微組織（圖2）。通過微流控技術(shù)制備的PLGA PMs平均粒徑為395 μm，擁有開放且相互貫通的孔洞，孔徑為10-60 μm。在PLGA PMs中接種C2C12，通過動(dòng)態(tài)培養(yǎng)法探索細(xì)胞組織聚集體的形成條件及肌肉微組織的形成過程，構(gòu)建3D肌肉微組織模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)7天后，分散性良好的微球之間開始聚集，并在后續(xù)培養(yǎng)過程中形成組織團(tuán)塊。

圖2. 基于PLGA PMs體外構(gòu)建肌肉微組織

  然后，通過微流控技術(shù)和光聚合技術(shù)相結(jié)合得到負(fù)載HUVECs的中空短棒狀血管微組織。以丙烯酸-聚乙二醇-琥珀酰亞胺基羧甲基酯（Acr-PEG-NHS）為原料，以共價(jià)修飾的方法得到了細(xì)胞活性好的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-PEG-Acr（RGD-PEG-Acr）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-PEG-Acr（VEGF-PEG-Acr），并研究了修飾作用下材料的生物安全性及對(duì)HUVECs生長(zhǎng)的調(diào)控作用。另外，采用復(fù)乳法制備載堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的PLGA納米粒（NPs），并復(fù)合到PEG水凝膠網(wǎng)絡(luò)中（圖3）。利用微流控技術(shù)和UV引發(fā)光聚合技術(shù)制備了中空短棒狀微纖維，微纖維外徑約為350 μm、內(nèi)徑約為110 μm、厚度約為120 μm、長(zhǎng)度約為1.5 mm，DAPI染色結(jié)果表明體外培養(yǎng)5天后，支架仍具有良好的中空結(jié)構(gòu)及機(jī)械強(qiáng)度，HUVECs呈管狀分布；且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）方法分析結(jié)果顯示促血管生成素（Ang-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和酪氨酸激酶-2（Tie-2）中特定信號(hào)傳導(dǎo)部分的表達(dá)水平均有顯著性提升，表明了體外血管形成的趨勢(shì)。

圖3. 基于PEG HMs體外構(gòu)建血管微組織

  接著，為了進(jìn)一步研究共混后的肌肉微組織及血管微組織在體內(nèi)的作用情況，在已經(jīng)形成的肌缺損部位注射入混合肌肉微組織、血管微組織作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)分別注射生理鹽水、乙醇、空白支架、混合細(xì)胞懸液為對(duì)照組，以造模后不處理作為空白對(duì)照組，觀察SCID大體積肌缺損的肌肉修復(fù)和組織再生情況（圖4）。通過HE染色觀察注射后組織的水腫、纖維化、及肌細(xì)胞再生的情況。根據(jù)HE結(jié)果分析可以看出術(shù)后3 d內(nèi)屬肌組織的破壞、炎癥階段，3 d - 14 d為肌組織修復(fù)階段，注射入機(jī)體的PLGA PMs由于含有大量成熟的C2C12細(xì)胞，且體外實(shí)驗(yàn)證明，在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)下C2C12-PLGA PMs能夠出現(xiàn)自由聚集，這些聚集有助于微載體中的C2C12根據(jù)機(jī)體需要和自身的成肌細(xì)胞組裝形成中心排列的核進(jìn)而形成肌纖維。14 d - 28 d為肌組織重塑階段，對(duì)于實(shí)驗(yàn)組來說，成纖維細(xì)胞的增生為合成結(jié)締組織、為再生組織提供穩(wěn)定的微環(huán)境起到重要作用，肌組織的修復(fù)基本完成。

圖4. SCID右后腿脛前肌注射、肌肉微組織+血管微組織、乙醇、空白支架、生理鹽水、細(xì)胞混懸液及空白對(duì)照組不同時(shí)間后HE染色分析

  通過Masson染色觀察細(xì)胞在組織內(nèi)部的作用及肌肉的損傷、炎癥的修復(fù)及纖維化情況（圖5）。Masson染色觀察細(xì)胞在組織內(nèi)部的作用及肌肉的損傷、炎癥的修復(fù)及纖維化情況結(jié)果和HE染色結(jié)果大體一致，成纖維細(xì)胞的大量增殖過程導(dǎo)致了膠原纖維的產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后28 d時(shí)呈現(xiàn)出形狀規(guī)則、紅色均勻分布的肌組織形態(tài)，其它對(duì)照組均出現(xiàn)了不同程度的膠原纖維的過度再生和沉積，最終導(dǎo)致了瘢痕的形成，影響了骨骼肌組織功能的重建。

圖5. SCID右后腿脛前肌注射肌肉微組織+血管微組織、乙醇、空白支架、生理鹽水、細(xì)胞混懸液及空白對(duì)照組不同時(shí)間后的Masson染色分析

  最后，利用免疫熒光組織學(xué)染色觀察組織內(nèi)部不同組別血管生成相關(guān)因子CD31、VE-Cad的表達(dá)情況及肌纖維形成相關(guān)蛋白Desmin、MyoD的表達(dá)情況。研究結(jié)果表明，基于微流體控技術(shù)制備的大多孔高分子微球、中空短棒裝微纖維作為微載體在構(gòu)建血管化組織用于組織再生的研究具有潛在的應(yīng)用前景。

  以上相關(guān)成果以“Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration”為題，近期在線發(fā)表于《Biomaterials》。論文通訊作者為華僑大學(xué)陳愛政教授和哈佛醫(yī)學(xué)院Y. Shrike Zhang教授，論文第一作者為華僑大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)2020屆博士畢業(yè)生王穎。華僑大學(xué)王士斌教授、Ranjith Kumar Kankala副教授、張建庭講師、2020屆博士畢業(yè)唐含笑、2020屆碩士畢業(yè)蔡園園、復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院朱鎧副教授和福建醫(yī)科大學(xué)楊達(dá)云副教授為論文的共同作者。

  華僑大學(xué)部分的研究工作得到國家自然科學(xué)基金（81971734，32071323）、國家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合重點(diǎn)項(xiàng)目（U1605225）以及福建省生物材料科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目的資助。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.121072

作者簡(jiǎn)介：

陳愛政：博士、教授、博士生導(dǎo)師。

福建省優(yōu)秀教師，入選國家百千萬人才工程、被授予“有突出貢獻(xiàn)中青年專家”榮譽(yù)稱號(hào)。目前擔(dān)任中國生物材料學(xué)會(huì)理事、中國生物材料學(xué)會(huì)復(fù)合材料分會(huì)秘書長(zhǎng)、中國生物材料學(xué)會(huì)青年委員會(huì)委員、華僑大學(xué)生物材料與組織工程研究所所長(zhǎng)、福建省生物材料科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)帶頭人、福建省生物材料化工博士生導(dǎo)師團(tuán)隊(duì)帶頭人。主持國家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合重點(diǎn)項(xiàng)目、面上項(xiàng)目、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃政府間國際科技創(chuàng)新合作重點(diǎn)專項(xiàng)等國家級(jí)課題8項(xiàng)。主要從事超臨界流體技術(shù)及生物材料與組織工程領(lǐng)域的研究，已在AM、AFM、Small、JCR、CEJ、AHM、Biomaterials、Biofabrication等期刊發(fā)表SCI收錄論文100余篇，獲授權(quán)國家發(fā)明專利10余項(xiàng)。

課題組網(wǎng)頁：https://www.x-mol.com/groups/hqubiomat 

Y. Shrike Zhang：博士，美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院助理教授，2013年于Georgia Institute of Technology生物醫(yī)學(xué)工程系取得博士學(xué)位。研究領(lǐng)域包括生物打印及器官芯片的平臺(tái)搭建與應(yīng)用研究，在相關(guān)領(lǐng)域發(fā)表研究論文及綜述240余篇，包括以第一或通訊作者發(fā)表的PNAS、Science、Nat. Rev. Mater.、Nat. Rev. Nephrol.、Nat. Commun.、Matter、Adv. Mater.、ACS Nano、Angew. Chem. Int. Ed.、Biomaterials 等，其中超過45篇封面文章；研究成果曾被BBC、Fox News、The Boston Globe/STAT News、Science Daily、Technology Networks、IEEE Spectrum、C&EN、《科技日?qǐng)?bào)》等報(bào)道。擔(dān)任20余本雜志的主編、副主編或編委，曾獲得多種國際和地區(qū)性獎(jiǎng)項(xiàng)40余項(xiàng)。

課題組網(wǎng)頁：https://shrikezhang.com/