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  骨關(guān)節(jié)炎（OA）導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，已成為人類最致殘的關(guān)節(jié)疾病之一，其發(fā)展可歸因于關(guān)節(jié)軟骨及軟骨細胞外基質(zhì)（ECM）發(fā)生降解、滑膜炎癥以及軟骨下骨重塑。活化的巨噬細胞是聚集炎癥反應(yīng)的生物標志物，也是炎癥性疾病診斷和治療的主要靶點。促炎的M1型巨噬細胞極化為抗炎的M2型是有效緩解炎癥并改善組織修復(fù)的策略之一。乏氧微環(huán)境可誘導(dǎo)HIF-1α表達上調(diào)，影響巨噬細胞極化平衡。病理狀態(tài)下高水平的活性氧（ROS）往往介導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)展，不僅誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細胞凋亡，還可通過NF-κB信號通路激活M1巨噬細胞極化，加劇炎癥反應(yīng)。因此，清除細胞內(nèi)ROS和緩解乏氧可以有效阻斷M1表型極化并增強M2表型極化。

  適當調(diào)節(jié)骨免疫微環(huán)境（BIM）以促進骨組織修復(fù)和再生是逆轉(zhuǎn)OA病理變化的關(guān)鍵措施。M2表型巨噬細胞的轉(zhuǎn)化可以適當調(diào)節(jié)BIM，參與骨組織的修復(fù)和再生。促進巨噬細胞和間充質(zhì)干細胞（MSC）之間的相互作用，有利于協(xié)調(diào)骨分化和骨整合過程。因此，開發(fā)一種多功能納米藥物通過多角度治療OA的病理過程有望提高OA的療效。

  纖連蛋白（FN）是ECM中的一種主要非膠原糖蛋白，在介導(dǎo)細胞與細胞表面相互作用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。他們之前的工作表明，納米顆粒的FN涂層使其能夠特異性靶向高表達整合素α_vβ₃的腫瘤細胞，從而增強藥物傳遞效率并提高腫瘤的治療效果（ACS Nano 2022, 16, 984-996）。采用苯硼酸修飾的聚酰胺-胺樹狀大分子可將FN高效遞送至肺泡巨噬細胞內(nèi)，引導(dǎo)脂多糖（LPS）活化的巨噬細胞向抗炎M2表型極化，減少促炎因子分泌，增強ROS清除，從而舒緩急性肺損傷的癥狀（Biomacromolecules 2023, 24, 886-895）。將納米技術(shù)與FN相結(jié)合可有效發(fā)揮FN的抗炎和抗氧化功效，這對促進OA治療至關(guān)重要。

  含磷樹狀大分子具有與蛋白質(zhì)相似的精確分子結(jié)構(gòu)、理想的剛性和免疫調(diào)節(jié)活性，已被開發(fā)用于增強基因遞送、抗腫瘤治療和抗炎治療。本課題組先前構(gòu)建了亞磷酸鈉鹽修飾的含磷樹狀大分子膠束用于負載姜黃素，通過整合載體和藥物的抗炎特性可有效治療急性肺損傷（Theranostics 2022, 12, 3407-3419）。氮雜雙二甲基磷酸酯修飾的第4代含磷樹狀大分子（G4-TBP）具有優(yōu)異的抗炎作用，通過降低M1型巨噬細胞標志物的表達，并阻斷NF-κB從細胞質(zhì)到細胞核的快速易位，可有效抑制小鼠亞慢性炎癥的發(fā)展。然而，由于G4-TBP的水溶性差且缺乏對巨噬細胞的靶向特異性，限制了其應(yīng)用范圍。

  具有ROS響應(yīng)性的納米藥物制劑如膠束、聚合物納米顆�；蛩z已被開發(fā)用于緩釋藥物并減輕炎癥微環(huán)境中的氧化應(yīng)激。此外，采用修飾靶向肽如葉酸、透明質(zhì)酸或利用細胞膜仿生技術(shù)可以使納米藥物靶向至炎癥部位，提高生物相容性和延長體內(nèi)循環(huán)時間。因此，構(gòu)建將G4-TBP和FN共負載的ROS響應(yīng)性納米藥物制劑有望通過FN介導(dǎo)的巨噬細胞靶向性能和發(fā)揮兩者的生物學(xué)功能來協(xié)同調(diào)節(jié)骨微環(huán)境以治療OA。

  為解決以上問題，東華大學(xué)史向陽教授團隊與法國國家科學(xué)研究中心配位化學(xué)實驗室Jean-Pierre Majoral院士團隊合作構(gòu)建了一種共負載G4-TBP和FN的ROS響應(yīng)性聚合物納米顆粒用于OA的抗炎/抗氧化/骨分化聯(lián)合治療（圖1）。研究團隊首先將G4-TBP樹枝狀大分子負載到兩親性嵌段共聚物聚乙二醇-縮硫酮-聚乳酸-乙醇酸（HOOC-PEG-TK-PLGA）組裝的納米顆粒中，進一步將形成的具有羧酸表面的G4-TBP NPs通過酰胺鍵與FN共價結(jié)合，得到G4-TBP NPs-FN。所制備的納米藥物在生理條件下穩(wěn)定，在ROS存在下可以解離釋放FN和G4-TBP，并通過FN介導(dǎo)的靶向特異性靶向巨噬細胞，從而顯著提高FN和樹狀大分子的生物利用度。形成的G4-TBP NPs-FN在ROS清除、緩解缺氧、M2型巨噬細胞極化、抗凋亡以及為干細胞成骨分化產(chǎn)生有利的BIM等方面發(fā)揮綜合作用，可通過募集骨髓間充質(zhì)干細胞和成骨分化，抑制軟骨基質(zhì)降解和促進軟骨修復(fù)有效治療骨關(guān)節(jié)炎。 

圖1. G4-TBP NPs-FN的制備及其通過巨噬細胞極化、緩解氧化應(yīng)激和促進干細胞成骨分化用于聯(lián)合治療OA。

圖2.（A）G4-TBP NPs的TEM圖像；G4-TBP NPs-FN的（B）TEM圖像和（C）SEM圖像；（D）G4-TBP NPs和（E）G4-TBP NPs-FN的AFM圖像；（F）G4-TBP NPs-FN的SDS-PAGE分析結(jié)果；（G）G4-TBP NPs、FN和G4-TBP NPs-FN的紫外可見吸收光譜；各材料的水合粒徑（H）和電勢（I）。

圖3.（A）不同材料處理后RAW264.7細胞表面CD86和CD206表達水平的流式檢測結(jié)果；（B）不同組RAW264.7細胞M2/M1的比率；（C）不同材料處理后RAW264.7細胞中Arg-1和iNOS的表達水平；（D-E）WB實驗分析巨噬細胞p-PI3K/ p-Akt以及NF-κB通路；不同材料處理后，RAW264.7細胞中（F）TNF-α、（G）IL-1β和（H）IL-4的ELISA分析；（I）RAW264.7細胞凋亡情況代表性流式細胞術(shù)圖和（J）定量分析圖。

圖4. 用不同材料處理后RAW264.7細胞中（A）BMP-2和（B）GPNMB的相對mRNA表達的定量分析；與不同材料及其巨噬細胞培養(yǎng)基孵育后BMSCs中（C）Runx2和（D）OCN的相對mRNA表達水平；（E）用不同巨噬細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSC的ALP活性；（F）BMSCs的ALP染色和茜素紅染色結(jié)果。對于（A-B），Ⅰ，PBS；Ⅱ，LPS；Ⅲ，LPS+G4-TBP；Ⅳ，LPS+FN；V，LPS + G4-TBP NPs-BSA；VI，LPS + G4-TBP NPs-FN。

圖7.（A）體內(nèi)發(fā)光圖像和（B）不同治療后小鼠健康膝蓋和OA膝蓋的相對L-012發(fā)光強度；（C）WB分析和（D）不同治療后小鼠膝關(guān)節(jié)相對HIF-1α表達；（E）滑膜區(qū)域iNOS和CD206蛋白標記物的免疫熒光染色；（F）骨組織中CD146、BMP-2和OCN的代表性免疫組織化學(xué)染色。不同處理后（G）CD146、（H）BMP-2和（I）OCN陽性染色細胞的定量分析。

  簡而言之，該研究設(shè)計的納米藥物具有以下優(yōu)勢：1）有效提高了G4-TBP的水溶性和FN的細胞內(nèi)遞送效率，并使含磷樹枝狀大分子和FN在炎癥微環(huán)境中響應(yīng)釋放；2）不僅利用FN的RGD序列主動靶向巨噬細胞，而且將G4-TBP和FN各自固有的生物活性充分結(jié)合，通過清除ROS和緩解缺氧，有效緩解過度氧化應(yīng)激并保護細胞免于凋亡，從而抑制關(guān)節(jié)軟骨退化和滑膜炎的發(fā)生；3）通過巨噬細胞極化為M2型、骨間充質(zhì)干細胞募集和成骨分化刺激來調(diào)節(jié)BIM，進一步促進骨修復(fù)和骨整合。所開發(fā)的納米藥物制劑結(jié)合了生物活性含磷樹狀大分子和FN治療OA的優(yōu)勢，有望用于不同炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)治療。

  文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acsnano.4c00909