華僑大學(xué)陳愛政和南方醫(yī)大王穎 Compos. Part B：基于dECM工程化微組織協(xié)同增強(qiáng)分化和抗炎作用促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的軟骨再生
骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)囊炎癥為特征的慢性疾病，是導(dǎo)致全球殘疾的主要原因。伴有軟骨退化、異常骨質(zhì)增生或骨質(zhì)增生、滑膜，包括炎癥和軟骨下骨變化的病理臨床癥狀。軟骨對關(guān)節(jié)功能至關(guān)重要，尤其是承重和潤滑功能，軟骨的退化是導(dǎo)致殘疾的重要原因。目前，臨床上治療 OA 的主要軟骨再生系統(tǒng)一般分為非藥物、藥物和手術(shù)治療干預(yù)。然而，這些方法的適用性還面臨著一些挑戰(zhàn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有自我更新、多向分化和免疫調(diào)節(jié)的巨大潛力，因此特別適合解決與OA相關(guān)的復(fù)雜問題。BMSCs是誘導(dǎo)軟骨再生的一條極具前景的途徑。然而，要確保BMSCs能可靠地分化為軟骨細(xì)胞，許多參數(shù)都需要細(xì)致的優(yōu)化，如包括細(xì)胞數(shù)量、保留、存活以及與宿主組織的無縫整合。考慮到這些方面，團(tuán)隊設(shè)計了一種對BMSCs高；钚缘墓こ袒⒔M織定向調(diào)控BMSCs的軟骨細(xì)胞向分化，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高效、可重復(fù)的控制，提高了空間和時間效率。
在本研究中，華僑大學(xué)陳愛政教授課題組和南方醫(yī)科大學(xué)第十附屬醫(yī)院王穎副研究員課題組通過微流控技術(shù)構(gòu)建了一種基于軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)（dECM）和聚乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA），并成功包封了具有淫羊藿苷（ICA）的工程微載體。這種微載體與BMSCs共培養(yǎng)，被開發(fā)為一種面向OA軟骨再生的可注射工程化微組織。從機(jī)制上看，dECM通過可誘導(dǎo)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞表型，從而有效修復(fù)軟骨缺損。在抗炎方面，dECM增強(qiáng)BMSCs對活性抗炎物質(zhì)的分泌，負(fù)載的 ICA可持續(xù)釋放至微環(huán)境中，進(jìn)一步抑制局部炎癥反應(yīng)，減少軟骨組織的破壞，為穩(wěn)定關(guān)節(jié)微環(huán)境和促進(jìn)軟骨再生提供了重要保障。這種協(xié)同作用使工程化微組織在保護(hù)和修復(fù)軟骨方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢（圖1）。
圖1 研究示意圖
團(tuán)隊首先對dECM材料和天然軟骨進(jìn)行了詳細(xì)比較，重點(diǎn)分析了其組織成分的比例。結(jié)果顯示，dECM中高保留率的軟骨ECM成分。此外，檢測發(fā)現(xiàn)dECM的DNA含量低于50 ng/mL，表明其免疫原性已被有效去除，使其能夠安全應(yīng)用于后續(xù)的生物實(shí)驗(yàn)。接著，團(tuán)隊系統(tǒng)評估了ICA@dECM-PLGA多孔微球的理化特性。通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察發(fā)現(xiàn)，這種微球具有高度多孔的結(jié)構(gòu)，其相互連通的高孔隙率顯著提高了細(xì)胞的粘附性和滲透能力（圖2）。此外，微球中包埋的ICA表現(xiàn)出卓越的長效緩釋性能，不僅延長了藥物的作用時間，還為軟骨修復(fù)提供了持續(xù)的抗炎微環(huán)境支持，為軟骨修復(fù)提供了可靠的基礎(chǔ)。
圖2. ICA@dECM-PLGA PMs的生物和理化表征
如圖3所示，團(tuán)隊系統(tǒng)地評價了基于ICA@dECM-PLGA工程化微組織的再生機(jī)制及其在軟骨修復(fù)中的潛力。首先，通過H&E染色和番紅染色，團(tuán)隊觀察并分析了微組織內(nèi)細(xì)胞的活性狀態(tài)。結(jié)果顯示，細(xì)胞在微組織中保持良好的活性，能夠牢固接合，其形態(tài)呈現(xiàn)舒展?fàn)顟B(tài)，并形成了相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這種細(xì)胞狀態(tài)不僅表明微組織提供了一個適宜細(xì)胞黏附與增殖的環(huán)境，也為后續(xù)的軟骨組織再生奠定了良好基礎(chǔ)。進(jìn)一步，通過Col-2熒光染色，團(tuán)隊檢測到了大量軟骨基質(zhì)的沉積，明確顯示了該系統(tǒng)在軟骨修復(fù)中的潛力。Col-2是軟骨組織的重要標(biāo)志物，其大量生成表明工程化微組織能夠有效促進(jìn)軟骨組織的生成與重建。同時，這些結(jié)果也驗(yàn)證了ICA@dECM-PLGA工程化微組織在改善軟骨微環(huán)境方面的優(yōu)勢。最后，通過PCR分析顯示該系統(tǒng)顯著促進(jìn)了BMSCs向軟骨分化，同時表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗凋亡活性。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明，ICA@dECM-PLGA工程化微組織在促進(jìn)細(xì)胞分化、維持細(xì)胞活力以及提供理想軟骨修復(fù)條件方面具有重要作用。這些研究為后期工程化微組織在軟骨組織修復(fù)中的植入應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
圖3. 工程化微組織活性狀態(tài)及促軟骨分化的表征
炎癥因子的過度釋放是阻礙OA軟骨再生的主要挑戰(zhàn)之一。這些炎癥因子通過破壞軟骨細(xì)胞在合成與分解之間的動態(tài)平衡，嚴(yán)重削弱軟骨組織的修復(fù)能力，從而加劇了軟骨的退化進(jìn)程。因此，為OA軟骨再生提供穩(wěn)定的抗炎微環(huán)境是軟骨修復(fù)研究的關(guān)鍵目標(biāo)。如圖 4所示，為了評估工程化微組織在抗炎環(huán)境中的作用，團(tuán)隊構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)的炎癥模型，對工程化微組織的抗炎性能進(jìn)行了分析。工程化微組織對炎癥因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）水平的顯著降低，表明其在緩解炎癥反應(yīng)方面具有優(yōu)越性能。此外，團(tuán)隊進(jìn)一步收集了工程化微組織的培養(yǎng)上清液，并通過將其凍干后與新鮮培養(yǎng)基混合，與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，以測試工程化微組織對對軟骨細(xì)胞的調(diào)控。結(jié)果顯示，結(jié)果顯示工程化微組織可有效清除軟骨的活性氧和活性氮在抗炎修復(fù)展現(xiàn)出優(yōu)異性能。綜合來看，該工程化微組織在改善炎癥微環(huán)境、清除有害代謝物具有一定潛力。
圖4. 工程化微組織的抗炎特性
通過代謝組學(xué)分析，識別了差異代謝物小分子，并構(gòu)建了它們的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖和KEGG富集途徑圖。結(jié)果顯示，在工程化微組織作用下，BMSCs顯著上調(diào)了與細(xì)胞核蛋白合成、線粒體活性及能量代謝相關(guān)的關(guān)鍵通路。這種代謝激活不僅增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移和增殖能力，還優(yōu)化了其對外界刺激的響應(yīng)能力，為后續(xù)體內(nèi)注射時維持細(xì)胞高活性提供了堅實(shí)基礎(chǔ)。此外，高活性的BMSCs在免疫調(diào)控方面展現(xiàn)出巨大潛力。研究表明，這些細(xì)胞能夠通過分泌抗炎因子和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性，有效改善炎癥微環(huán)境，進(jìn)一步鞏固工程化微組織的抗炎性能，穩(wěn)定微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，為后續(xù)軟骨組織的再生提供理想條件？傊，代謝組學(xué)分析從分子水平全面揭示了工程化微組織對BMSCs功能的深遠(yuǎn)影響，進(jìn)一步從多角度側(cè)面驗(yàn)證了其在促進(jìn)軟骨再生和抗炎調(diào)控中的潛力（圖5）。這一結(jié)果不僅為相關(guān)機(jī)制研究提了重要理論支持，也為未來開發(fā)針對OA的精準(zhǔn)治療策略奠定了基礎(chǔ)。
圖5. 代謝組學(xué)分析
如圖6所示，團(tuán)隊通過解剖評估直觀展示了注射工程化微組織后各組的軟骨修復(fù)情況。在OA組中，明顯觀察到周圍滑膜紅腫、粘連，關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨表面存在多處潰瘍，且軟骨組織出現(xiàn)嚴(yán)重磨損甚至剝蝕，表現(xiàn)出典型的OA病理特征。相比之下，經(jīng)過工程化微組織治療的組別顯示出顯著的修復(fù)效果，軟骨表面僅有少量輕微磨損，滑膜邊界清晰可見，關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)接近正常，表明工程化微組織在保護(hù)和修復(fù)軟骨組織方面具有顯著優(yōu)勢。進(jìn)一步，為了量化各組炎癥狀態(tài)的差異，團(tuán)隊采用近紅外熱成像技術(shù)監(jiān)測了關(guān)節(jié)部位的局部溫度變化。結(jié)果顯示，OA組的局部溫度顯著升高，反映出明顯的炎癥反應(yīng)，而工程化微組織治療組的局部溫度接近正常水平，提示其有效降低了關(guān)節(jié)部位的炎癥活性。此外，團(tuán)隊結(jié)合血常規(guī)分析和血清上清液檢測評估了炎癥因子的表達(dá)水平，包括IL-1β、IL-6和TNF-α等重要炎癥標(biāo)志物。結(jié)果表明，工程化微組織治療組顯著降低了這些炎癥因子的水平，進(jìn)一步證實(shí)了其在調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境方面的作用。這些研究結(jié)果表明，工程化微組織能夠有效緩解OA的炎癥反應(yīng)，并在保護(hù)滑膜和穩(wěn)定關(guān)節(jié)微環(huán)境方面發(fā)揮了重要作用。
圖6. 工程化微組織治療后大鼠炎癥因子和血細(xì)胞的體內(nèi)評價
團(tuán)隊進(jìn)一步評估了OA治療后組織形態(tài)學(xué)特征。如圖7所示，軟骨表面切片的H&E染色結(jié)果顯示，在OA組中，軟骨細(xì)胞明顯脫落，軟骨組織出現(xiàn)侵蝕，間質(zhì)內(nèi)縱向和橫向斷裂明顯，呈現(xiàn)典型的OA病理特征。相比之下，接受工程化微組織治療的組別顯示組織邊界平整光滑，僅有少量軟骨碎屑，且未觀察到明顯的組織損傷，表明治療顯著改善了軟骨結(jié)構(gòu)完整性。番紅/固綠染色進(jìn)一步驗(yàn)證了顯示在工程化微組織治療組中，僅觀察到少量軟骨細(xì)胞脫落，軟骨表面光滑，細(xì)胞間連接緊密，表明軟骨組織的結(jié)構(gòu)得到了顯著改善。此外，團(tuán)隊采用Micro-CT技術(shù)評估了軟骨下骨的鈣沉積和骨密度變化。結(jié)果顯示，在OA模型組中，大鼠表現(xiàn)出明顯的OA特征，骨質(zhì)侵蝕軟骨下骨排列紊亂不均勻,關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)緣可見骨贅形成。與OA組相比，工程化微組織治療組的骨形成和軟骨下骨密度顯著增加，提示微組織有效促進(jìn)了骨組織的修復(fù)和重建。因此，團(tuán)隊設(shè)計的工程化微組織在軟骨生成和抗炎調(diào)控方面表現(xiàn)出顯著效果，可有效改善OA病理狀態(tài)，顯示了其在OA治療中的潛在應(yīng)用價值。
圖7. 工程化微組織治療后軟骨和骨組織的形態(tài)學(xué)評價
以上相關(guān)成果以“Engineered dECM-based microsystem promotes cartilage regeneration in osteoarthritis by synergistically enhancing chondrogenesis of BMSCs and anti-inflammatory effect”為題，近期在線發(fā)表于《Composites Part B: Engineering》。論文通訊作者為華僑大學(xué)陳愛政教授和南方醫(yī)科大學(xué)第十附屬醫(yī)院王穎副研究員，論文第一作者為南方醫(yī)科大學(xué)第十附屬醫(yī)院和華僑大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)學(xué)生2023屆碩士畢業(yè)生陳影和華僑大學(xué)2021級博士生陳林飛。
研究工作得到國家自然科學(xué)基金（32071323、32271410、32201110）、廣東省自然科學(xué)基金（2022A1515011442）以及福建省生物材料科技創(chuàng)新團(tuán)隊項(xiàng)目的資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.compositesb.2024.111974
通訊作者簡介：
陳愛政：博士、教授、博士生導(dǎo)師。
華僑大學(xué)化工學(xué)院院長、生物材料與組織工程研究所所長，享受國務(wù)院政府特殊津貼專家，入選國家百千萬人才工程、被授予“有突出貢獻(xiàn)中青年專家”榮譽(yù)稱號，入選福建省A類高層次人才，獲福建省優(yōu)秀教師等榮譽(yù)。目前擔(dān)任中國生物材料學(xué)會理事、中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會理事、中國生物材料學(xué)會生物復(fù)合材料分會秘書長、生物醫(yī)用材料閩臺科技合作基地負(fù)責(zé)人、福建省生物材料科技創(chuàng)新團(tuán)隊帶頭人、福建省生物材料化工博士生導(dǎo)師團(tuán)隊帶頭人、福建省黨外知識分子聯(lián)誼會副會長。主持國家重點(diǎn)研發(fā)計劃政府間國際科技創(chuàng)新合作重點(diǎn)專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合重點(diǎn)項(xiàng)目等國家級課題10項(xiàng)。主要從事超臨界流體技術(shù)及生物材料與組織工程領(lǐng)域的研究，以通訊作者在AM、AFM、Adv Sci、Small、JCR、AHM、BAM、Biomaterials等期刊發(fā)表SCI收錄論文150余篇，獲授權(quán)國家發(fā)明專利10余項(xiàng)。課題組網(wǎng)頁：https://www.x-mol.com/groups/hqubiomat
王穎：博士、副研究員、碩士生導(dǎo)師
王穎，副研究員，碩士生導(dǎo)師，東莞市特色人才第三類別，東莞智能生物材料與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任，南方醫(yī)科大學(xué)高層次引進(jìn)人才，多倫多大學(xué)博士后，自2021年12月起至今擔(dān)任《中國材料科學(xué)進(jìn)展》編委。主要從事于病理組織模型構(gòu)建和器官芯片的研究工作，包括水凝膠、高分子聚合物等生物材料、血管化組織工程、藥物篩選、微流控技術(shù)、生物3D打印等相關(guān)研究。主持國家自然科學(xué)基金青年基金1項(xiàng)、廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目1項(xiàng)、廣東區(qū)域聯(lián)合基金地區(qū)培育項(xiàng)目1項(xiàng)、東莞市社會發(fā)展科技重點(diǎn)項(xiàng)目1項(xiàng)。研究成果以通訊作者、第一作者在包括Adv Sci、Biomaterials、BAM、Composites Part B: Engineering、Biofabrication等國際一流學(xué)術(shù)期刊累計發(fā)表SCI論文20余篇。
