清華大學(xué)陳國強(qiáng)教授、吳瓊副教授 Adv. Sci.: 以聚羥基脂肪酸酯為例探究細(xì)胞體積大小對(duì)工業(yè)生產(chǎn)的影響
大多數(shù)細(xì)菌只有1~2微米大，這樣微小的空間限制了胞內(nèi)產(chǎn)物（如聚羥基脂肪酸酯，PHA）的積累。細(xì)胞體積的大小主要受mreB、minCD等關(guān)鍵基因的調(diào)控，但改變這些基因的表達(dá)量對(duì)生長產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，開發(fā)一種在不影響細(xì)胞生長的前提下增大細(xì)胞體積的方法顯得尤為重要。本研究通過改造細(xì)菌內(nèi)的ClpXP蛋白降解系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)MreB蛋白的可控降解。在此基礎(chǔ)上，通過過表達(dá)PHA合成相關(guān)基因phaAB并敲除PHA顆粒表面蛋白PhaP1，成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞體積的顯著增大（超過9倍）以及PHA產(chǎn)量的提升。在5噸發(fā)酵罐中，改造后的鹽單胞菌CYL0307在發(fā)酵44小時(shí)后，干重達(dá)到149g/L，PHA含量達(dá)到82%。
細(xì)菌的微小體積限制了胞內(nèi)產(chǎn)物的積累，然而對(duì)細(xì)胞骨架蛋白MreB以及分裂相關(guān)蛋白MinCD的調(diào)控對(duì)細(xì)菌生長造成負(fù)面影響。因此，需要開發(fā)一種在不影響細(xì)菌生長的前提下增大細(xì)胞體積的方法。本研究改造細(xì)菌內(nèi)的ClpXP蛋白降解系統(tǒng)并將其應(yīng)用于MreB的可控降解，在此基礎(chǔ)上敲除PHA顆粒表面蛋白PhaP1同時(shí)過表達(dá)PHA合成相關(guān)基因phaAB，最終成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞體積的顯著增大（九倍以上），PHA產(chǎn)量的提高和下游提取過程的簡(jiǎn)化。
細(xì)菌內(nèi)有多種蛋白降解系統(tǒng)，其中研究最為廣泛的是ClpXP蛋白降解系統(tǒng)。在翻譯過程中，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在核糖體上發(fā)生停滯時(shí)，細(xì)菌內(nèi)的tmRNA（transfer-messenger RNA）會(huì)在停滯蛋白的C端加上SsrA標(biāo)簽。該SsrA標(biāo)簽可以與細(xì)菌內(nèi)的ClpXP蛋白酶特異性結(jié)合，從而促使停滯蛋白被降解。在本研究中，他們通過突變SsrA標(biāo)簽的序列，調(diào)節(jié)其與ClpXP蛋白酶之間的相互作用強(qiáng)度，進(jìn)而開發(fā)出一系列具有不同降解速率的突變標(biāo)簽（圖1）。
圖1 突變后具有不同降解速率的標(biāo)簽
在此基礎(chǔ)上，他們將突變后具有不同降解速率的SsrA標(biāo)簽的DNA序列插入細(xì)菌基因組中mreB基因的終止密碼子前，使MreB蛋白在翻譯時(shí)就帶有SsrA標(biāo)簽。鑒于MreB蛋白在維持細(xì)菌桿狀形態(tài)中的關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)其降解速率，他們期望能夠增加細(xì)菌寬度，獲得更接近球形的細(xì)菌。通過顯微鏡觀察，他們發(fā)現(xiàn)所有經(jīng)過基因編輯的細(xì)菌均呈現(xiàn)出更大的橢球狀形態(tài)，而對(duì)照菌株CYL0119則保持了較小的桿狀形態(tài)（圖2A）。進(jìn)一步測(cè)試這些細(xì)菌的干重和PHA含量后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照菌株相比，經(jīng)過改造的工程菌株CYL0212的干重和PHA含量分別提高了14.2%和5%。（圖2B）。
圖2 降解MreB蛋白對(duì)細(xì)菌形態(tài)和PHA生產(chǎn)性能的影響
為了進(jìn)一步增大細(xì)菌的體積，在CYL0212中過表達(dá)了minCD基因，MinCD蛋白與細(xì)胞分裂環(huán)的形成密切相關(guān)，其表達(dá)水平提高能抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞變長。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，過表達(dá)minCD確實(shí)進(jìn)一步增大了橢球形細(xì)菌的體積（圖3A）。然而，在測(cè)量細(xì)胞干重和PHA含量后發(fā)現(xiàn)，這一操作顯著降低了細(xì)胞干重和PHA含量。因此，僅降解MreB的菌株被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖3B）。
圖3 通過過表達(dá)minCD進(jìn)一步增大細(xì)胞體積，但降低干重和PHA含量
先前的研究表明，敲除PHA表面結(jié)合蛋白PhaP1會(huì)導(dǎo)致PHA顆粒發(fā)生融合，形成更大的顆粒，這有利于工業(yè)生產(chǎn)中的PHA提取過程�；谶@一發(fā)現(xiàn)，他們?cè)诰闏YL0212中敲除了phaP1基因，構(gòu)建了工程菌株CYL0213，并利用透射電子顯微鏡對(duì)其內(nèi)部的PHA顆粒進(jìn)行了觀察（圖4A）。結(jié)果表明，當(dāng)phaP1基因被敲除后，PHA顆粒的直徑從0.63微米增加至1.67微米（圖4B）�？紤]到橢球形細(xì)菌體積的增大為其提供了更多空間用于PHA積累，他們?cè)贑YL0213中過表達(dá)了PHA合成相關(guān)基因phaAB，構(gòu)建了工程菌CYL0307，與對(duì)照菌株相比，CYL0307的細(xì)胞干重從17.2g/L提高至20.8g/L， PHA含量從73.3%提高至78.4%（圖4C）。
圖4 通過敲除phaP1和過表達(dá)phaAB優(yōu)化PHA的生產(chǎn)過程
接下來，他們將CYL0307用于7升、100升以及5噸發(fā)酵罐中進(jìn)行PHA生產(chǎn)，以評(píng)估其在工業(yè)生產(chǎn)和提取過程中的性能表現(xiàn)。在PHA生產(chǎn)能力方面，結(jié)果顯示，工程菌CYL0307在不同規(guī)模發(fā)酵罐中的PHA產(chǎn)量均優(yōu)于對(duì)照菌株。特別是在5噸發(fā)酵罐中，經(jīng)過44小時(shí)發(fā)酵，CYL0307的細(xì)胞干重高達(dá)149g/L，PHA含量達(dá)到82%。而對(duì)照菌株在相同條件下干重僅為104g/L，PHA含量?jī)H76%。在下游提取過程中，CYL0307也展現(xiàn)出多方面的優(yōu)勢(shì)。首先，由于工程菌更大更重，其在發(fā)酵液中的沉降性能顯著增強(qiáng)，更易通過離心分離。在4000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，工程菌僅需離心4分鐘即可從發(fā)酵液中完全分離，而對(duì)照菌株則無法實(shí)現(xiàn)有效分離（圖5A）。其次，工程菌從桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)榍驙�，�?xì)胞壁被延展，表面變得粗糙不平，這種結(jié)構(gòu)變化說明細(xì)胞壁被破壞，從而可以更高效地提取胞內(nèi)PHA顆粒。與對(duì)照菌株相比，工程菌在破壁過程中溶菌酶使用量減少了28%（圖5B和5C）。此外，通過掃描電子顯微鏡觀察發(fā)酵結(jié)束后的菌株的形態(tài)，并計(jì)算其體積，結(jié)果顯示，CYL0307呈現(xiàn)出球狀結(jié)構(gòu)，體積較對(duì)照菌株增大九倍以上（圖5D和5E）。
圖5 球形菌的下游提取優(yōu)勢(shì)
總結(jié)：本研究在非模式菌鹽單胞菌中開發(fā)了一種基于翻譯后修飾的蛋白質(zhì)降解技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)蛋白MreB的可控降解。在此基礎(chǔ)上，通過敲除phaP1和過表達(dá)phaAB，成功使細(xì)菌體積增大九倍以上，并顯著提高了PHA的產(chǎn)量。此外，該技術(shù)還簡(jiǎn)化了下游離心分離過程，并減少了溶菌酶的使用量，從而提升了PHA生產(chǎn)的效率和經(jīng)濟(jì)性。文章第一作者為清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生陳翊苓，文章通訊作者為清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳國強(qiáng)教授和吳瓊副教授。
鏈接地址：https://doi.org/10.1002/advs.202412256
陳國強(qiáng)教授簡(jiǎn)介
陳國強(qiáng)，1994年被聘為清華大學(xué)副教授，1997－今聘為清華大學(xué)教授，2003－2009年兼任汕頭大學(xué)多學(xué)科研究中心主任。長期從事“生物合成PHA材料及其下一代工業(yè)生物技術(shù)”的研究。學(xué)術(shù)論文在Google Scholar引用4萬多次，H指數(shù)105。獲得授權(quán)專利70多項(xiàng)，50個(gè)公開專利。開發(fā)的PHA技術(shù)已經(jīng)在數(shù)家公司用于大規(guī)模生產(chǎn)微生物塑料聚羥基脂肪酸酯PHA，使我國成為PHA領(lǐng)域國際上學(xué)術(shù)和產(chǎn)業(yè)最發(fā)達(dá)的國家、以及PHA醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究做多的國家，開發(fā)了多種PHA以及降解單體的多種應(yīng)用。獲得的榮譽(yù)包括：國際生物聚合物（ISBP）工業(yè)獎(jiǎng)（2024）；國際代謝工程獎(jiǎng)（2023）、自然資源科學(xué)技術(shù)二等獎(jiǎng)（2022）、全國先進(jìn)科技工作者（2016）、候德傍化工創(chuàng)新獎(jiǎng)（2015）、首屆閔恩澤能源化工杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)（2013）、談家禎生命科學(xué)創(chuàng)新獎(jiǎng)（2011）、教育部長江學(xué)者特聘教授（2004）、教育部高校青年教師獎(jiǎng)（2004）、第八屆中國青年科技獎(jiǎng)（2003）、紐倫堡國際發(fā)明獎(jiǎng)（2003）、茅以升科技獎(jiǎng)（2003）、自然科學(xué)基金委國家杰出青年（2002）、 國家發(fā)明二等獎(jiǎng)(排名第一)（2002）等。是973“合成生物學(xué)”項(xiàng)目以及國家重大專項(xiàng)項(xiàng)目的首席科學(xué)家、清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心主任、英國曼徹斯特大學(xué)兼職講座教授。曾連續(xù)6年獲得清華大學(xué)學(xué)生“良師益友”的光榮稱號(hào)，進(jìn)入清華大學(xué)“良師益友”名人堂。連續(xù)9年獲得清華大學(xué)高論文他引的“梅貽琦獎(jiǎng)”。連續(xù)八年獲得Elsevier出版社生化與分子生物學(xué)高引用作者。學(xué)術(shù)服務(wù)：擔(dān)任國際期刊《Biotechnology Advances》和《Synthetic and Systems Biotechnology》主編，《生物工程學(xué)報(bào)》、《合成生物學(xué)》、《Journal of Biotechnology》 、《Microbial Cell Factories》、《Biotechnology Journal》和《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》副主編。另擔(dān)任國際學(xué)術(shù)期刊編委《Trends in Biotechnology》、《Current Opinions in Biotechnology》、《Metabolic Engineering》、《ACS Synthetic Biology》、《Microbial Biotechnology》、《Applied Microbiology and Biotechnology》、《Biomaterials》、《Biomacromolecules》和《Metabolic Engineering Communications》。
電郵: chengq@tsinghua.edu.cn
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