中國科學技術大學化學與材料科學學院閆立峰教授團隊以側鏈帶有羧基（-COOH）的天然二胺-賴氨酸為單體，利用有機超強堿DBU催化體系成功合成了賴氨酸-CO2基聚脲（L-PU）。實驗表明，CO2以脲基團的形式（-NHCONH-）嵌入到主鏈，側鏈活性羧基的保留率超過80%。同時產物具有非典型熒光特性，產物L-PU的熒光量子產率超過20%。L-PU對HepG2細胞的培養(yǎng)存活率超過90%，可高效標記細胞質，展現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性與成像性能。此外，L-PU保留的活性羧基具有進一步功能化的改性空間，增加了其作為水溶性高分子的應用潛力。第一作者為中科大2022級博士研究生張尚中。
圖1. L-賴氨酸捕獲 CO2并產生聚脲過程可能的機理
該團隊直接使用 L-賴氨酸作為二胺原料，在有機超強堿 DBU 的活化下，與 CO2 在溫和的溫度和壓力下（0.1-0.4 MPa，60-100 ℃）進行捕獲和聚合反應，成功制備了一種新型水溶性聚脲（L-PU）。
圖2. a) L-PU 聚合物的 13C NMR 譜（0.4 MPa, 80 ℃,12 h）；b) L-PU 聚合物的 1H NMR譜（0.4 MPa, 80 ℃,12 h）；c) 信號 1c 放大視圖；d)分子鏈中三種可能存在形式
在圖2a 中，可觀察到六個高化學位移的碳信號，將其按化學位移從低到高進行分類和歸屬，如圖2 b，c，d所示。賴氨酸分子中共有五個碳原子，除了 1 號位置的碳原子只連著一個氫原子外，其它每個碳原子連著兩個氫原子。而 1 號位置的碳原子共有 1a，1b 和 1c 三種連接情況。由此可見，信號 1-a、1-b、1-c 的合起來積分面積為 1 號碳原子總積分面積，1 號碳原子與其它碳的積分面積比值為 0.5:1:1:1:1。其中，信號 1-a 表示與 1 號碳原子相鄰的脲基團，其另一側無羧基；而信號 1-b 表示，在脲基團的另一側有一個羧基。因此，由于另一側羧基的吸電子作用，信號 1-b 的化學位移值相對于信號 1-a 有明顯的增加。信號 1-a 與 1-b 的積分面積之比為 37:4，這是因為 1-a 是由賴氨酸中不與羧基相鄰的氨基捕獲 CO2 形成，其形成過程相比與 1-b 具有較低的位阻以及親核性的優(yōu)勢，所以最終數(shù)量占優(yōu)。
1-c 信號代表由 1-a 結構進行分子內脫水，進而形成的五元環(huán)結構，其對應的化學位移更大。如圖 5c 所示，核磁共振氫譜中 1-c 的信號為雙二重峰（d-d 峰）。這種光譜特征表明，1-c 上的氫原子受到位于不同化學環(huán)境中的兩個相鄰氫原子的影響。在五元環(huán)結構中，2 號碳上的兩個氫原子由于平面構象中位置不同，處在不同的化學環(huán)境，即滿足這種情況。所以，上述對分子內產生五元環(huán)結構的假設，得到了有力的證據(jù)支持。
此外，當該反應在不同的條件下進行時， 1-a、1-b 和 1-c 三個信號的峰值形狀和比例幾乎沒有變化，大約是 70%:10%:20%。這說明，L-PU 中的三種結構在熱力學上是較為穩(wěn)定的。由此可知，活性羧基的保留率為 1-a 與 1-b 所占比例之和，約為 80%。
圖3. L-PU在不同條件下的GPC曲線。（除特殊說明外，基本條件為0.4 MPa, 80℃，12h）。a)不同壓強, b)不同溫度, c)不同時間, d)不同時間合成的L-PU水溶液（2mg/ml）動態(tài)光散射（DLS）試驗
圖3a 表明，當 CO2 壓力從 0.4 MPa 降低到 0.1 MPa 時，L-PU 的重均分子量（Mw）增加，從 1.09×104 g/mol 增加到 2.47×104 g/mol, 表明即使在較低壓力下，CO2 也能與賴氨酸進行有效聚合。 如圖3b所示，溫度升高導致重均分子量增加，而分散系數(shù)（PD）相對變化很小。這是因為溫度的升高增加了反應的能量供給，降低了體系粘度，提高了傳質效率。 當反應時間從 4 h 增加到 12h 時，分子量略有增加（從 1.05×104 g/mol 增加到 1.09×104 g/mol），表明鏈生長過程主要發(fā)生在反應的前 4 小時。然而，當反應時間從 12 小時增加到 24 小時，重均分子量和分散系數(shù)均顯著增加（分散系數(shù)從 1.82 增加到 2.53），表明長時間加熱可能導致分子間的鏈間反應。 圖 3d進一步支持了這一觀察結果，反應 24 h 后的 L-PU 水溶液由于分子鏈之間的反應和纏結，粒徑更大，分布更廣。
圖4 純化的 L-PU 聚合物的 SEM 照片（0.4 MPa,12 h,80 ℃）
純化后的 L-PU 固體粉末的微觀形態(tài)特征如圖 4.14 所示，通過 SEM 的表征方法，可以清楚地看到顆粒呈現(xiàn)出細長片狀的形態(tài)。這可以歸因于分子鏈中存在大量氫鍵，導致聚合物鏈間密集排列。
圖5. a)不同條件下 L-PU 聚合物的紫外吸收光譜, b)不同條件下 L-PU 聚合物的熒光發(fā)射光譜， c) 不同壓強下合成的 L-PU 聚合物的熒光量子產率與濃度變化關系 4 （12 h,80 ℃,λex=310 nm）, d) 不同反應時間下合成的 L-PU 聚合物的熒光量子產率與濃度變化關系
L-PU 聚合物的熒光強度隨溶液中自身濃度的增加而降低，符合 ACQ （Aggregation-Caused Quenching）的原理。圖5a中的 L-PU 聚合物，隨著分子量的逐漸增加，其對應的紫外吸收峰從 302 nm 逐漸增加到 314 nm， 這說明非常規(guī)的本征熒光性質與聚脲的分子量有直接關系。在 310 nm 激發(fā)波長下，L-PU 聚合物在各種條件下都可以觀察到熒光現(xiàn)象，如圖5b所示。發(fā)射峰出現(xiàn)在 410 nm 左右。圖 5c和5d的結果證實了 L-PU 聚合物的熒光量子產率隨著濃度的增加而逐漸降低，符合聚集誘導猝滅（Aggregation-Caused Quenching）。
值得注意的是，在 0.1 MPa 的 CO2 壓力下合成的 L-PU 聚合物的量子產率高于 0.4 MPa 條件下的，而反應時間 24 小時合成的 L-PU 聚合物的量子產率超過了 12 小時合成的聚合物，說明熒光量子產率與分子量呈正相關。在測試過程中，觀察到的 L-PU 聚合物的最大熒光量子產率達到了 20.39%，顯著高于單體賴氨酸的熒光量子產率（5.35%）。
利用YO-PRO1 細胞核染色液其進行了細胞核染色成像（圖 6）。
圖6. 被 L-PU 和 YO-PRO1 染色劑處理的 HepG2 細胞的熒光圖像
HepG2 細胞在攝取了含有 L-PU 聚合物的培養(yǎng)液 6 小時后，熒光圖像顯示 L-PU 分子存在于細胞質區(qū)。12 小時后，L-PU 聚合物的熒光強度顯著增強，并保持相對穩(wěn)定，直至 24 小時（圖 7a）。 MTT 法測定細胞毒性如圖7b所示，在攝取含有不同濃度 L-PU 的培養(yǎng)液情況下，測試細胞存活率保持在 90%以上，表明 L-PU 聚合物具有優(yōu)異的生物相容性和細胞安全性。
圖7. a)L-PU 處理不同時間后 HepG2 細胞的熒光強度, b) L-PU 對 HepG2 細胞的 MTT 分析（n = 4, mean±SD）, c) L-PU 溶液和水在 365nm 紫外光下對比（80 ℃,12 h, 0.4 MPa,2 mg/mL）, d) 經過 L-PU 染色的細胞輪廓（80 ℃,12 h, 0.4 MPa,2 mg/mL）
L-PU 聚合物水溶液具有肉眼可見的顯著熒光效果，如圖7c所示。 此外，圖7d顯示了攝取 L-PU 聚合物后完整清晰的細胞輪廓，細胞邊緣輪廓清晰，形狀完好，這表明 L-PU 聚合物具有優(yōu)異的細胞親和性，因為它很容易被細胞吸收，同時保持了細胞的自然形態(tài)。
DSC 測試的結果表明（圖8a），L-PU 的玻璃化轉變溫度隨著重均分子量的增加而逐漸升高。較高的分子量增強了分子鏈的剛性，也促進了更多分子間氫鍵相互作用。從圖8b 中可以看出，不同條件下合成的 L-PU 聚合物在 122 ℃和 203 ℃左右表現(xiàn)出兩個不同的失重步驟。在 122 ℃時，L-PU 聚合物分子失去了分子間結晶水，并在 203 ℃時開始分解。在 203 ℃附近的第一次失重，不同條件下 L-PU 聚合物沒有表現(xiàn)出顯著差異。然而，在 250 ℃附近的第二次失重，剩余質量表現(xiàn)出依賴于分子量的順序。例如，在 12 h、0.1 MPa、80 ℃條件下合成的 L-PU 聚合物在第二次失重過程中分子量最高，保留的質量最多。
圖8. a)不同條件下合成的 L-PU 聚合物的DSC曲線, b) 不同條件下合成的 L-PU 聚合物的熱重曲線
本研究成功開發(fā)了一種在溫和條件下利用 L-賴氨酸與CO2 高效聚合制備水溶性聚脲（L-PU）的新方法。通過 DBU 的催化作用，L-PU 不僅實現(xiàn)了 CO2 的高效固定，還保留了羧基的活性，為其在生物醫(yī)學領域的應用提供了廣闊的前景。L-PU 表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光性能和生物相容性，能夠高效標記細胞質，展現(xiàn)出其在細胞成像和組織治療中的潛在應用價值。
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.macromol.4c03112
