?!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"> 日本少妇人妻xxxxx18,波多野结衣办公室33分钟,欧美无MATE30PRO巨

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q期Q?/span>复旦大学丁徏东课题组设计q过微加工制备了h可拉伸Ş貌微l构的微控芯片Q在此基上构Zl胞(yu)的准三维黏附状态ƈq行循环拉刺激?/span>通过不同l胞(yu)和不同维度的研究表明Q准三维微环境介于二l和三维微环境，而且在许多方面，适当的准三维l胞(yu)可以模仿三维微环境中的细?yu)，同时又能像在二维上一h便地观察?/span>相关成果以标题ؓ?/span>Design and Aligner-assisted Fast Fabrication of a Microfluidic Platform for Quasi-3D Cell Studies on an Elastic Polymer?/span>发表?/span>?/span>Bioactive Materials》。复旦大学高分子U学pR聚合物分子工程国家重点实验室博士后研究?/span>宁博?/span>文第一作者，通讯作者ؓ该国重主?/span>丁徏东教?/span>。此研究得到国家自然U学基金{资助支持?/span>


作ؓ体外力学转导的基研究模型体系Q二l细?yu)拉伸研I相对容易，?/span>三维l胞(yu)拉模拟了细?yu)在体内的部分状态，可能对生物医学和生物材料研究产生更重要的影响。因此需要徏立一个准三维体外研究模型Q图1Q?/span>Q它既可以在一定程度上模拟l胞(yu)的三l行为，又借助二维模式的简单和便利?/span>



?/span>1. 本研I的基本思\?/span>(A) l胞(yu)响应准三l力学刺Ȁ的示意图?/span>(B) h拓扑微结构的PDMS膜的刉及l装?/span> 该微控芯片地制备存在诸多难点：首先Q?/span>需要进行两ơ对准；其次Q?/span>在对准之后还要立卌行等d体键?/span>以免失活Q?/span>此外Q硅晶片上的微图案通常难以观察清楚Q增加了对准隑ֺ?/span>Z解决q些问题Q研Ih员设计ƈl装了一U新型的芯片快速对准AQ图2Q。凭借该对准仪的预对准程序和有效观察的优点，在等d表面处理后可?/span>1分钟?/span>卛_完成对准和键合?/span>



?/span>2. 本研I开发的Z体式昑־镜的快速对准系l?/span>(A)三维拆分l构?/span>(B) 快速对准A的原型机。（CQ?/span>快速对准A的用实例?/span> ?/span>3A昄了键合后的芯片原件。在其右侧显CZ微井阵列成功地组装在微通道中间。该操作的技术难Ҏ(gu)微井阵列图案Q?/span>800 μm × 5 mm 的长条）准确地、^行地攄于微通道Q?/span>1 mm宽）之中。快速对准A有效地解决了该问题。芯片的横截面如?/span>3B 所C。弹性膜处在上下两个微通道层之间。两个侧腔中的膜通过 PDMS 蚀d?/span>除?/span>׃微通道侧壁U?/span>?/span>100 μm?/span>Q且?/span>?/span>下微通道侧壁寚w良好Q估计对?/span>_ֺ?/span> ? 10 μm。图3C 昄了直径ؓ10 μm?/span>25 μm?/span>40 μm三种微井阵列?SEM 囄?/span>



?/span>3. 微流控芯片的l构表征和微柱阵列?/span>(A) 键合有微井阵列的芯片照片。右图显C微井阵列^行排列在微通道中?/span>(B) 微流控芯片的横截面。右侧是膜上微柱的放大图像?/span>(C) 三种微井阵列?/span>SEM囄Q即微井（SQ、中微井Q?/span>MQ和大微井（LQ?/span>
zȝ?/span>?/span>拉和成像系l如?/span>4所C。该pȝ由压力控制器、注܇和配备有zȝ?yu)培ȝl的荧光昑־镜组成。通过微柱位移的图像分?/span>可知芯片?/span>?/span> 0-1 Hz 的频?/span>?/span>0-19%拉?/span>范围?/span>L调节。还?/span>?/span>2 Hz的频?/span>?/span>0-13%?/span>拉率下正常工作?/span>



?/span>4 (A) 微流?/span>拉׾pȝ?/span>(B) 不同拉频率下拉?/span>?/span>与压力的关系。理论结果代表来自有限元分析的静态拉?/span>?/span>?/span>
研究人员对细?yu)?/span>“类三维”状态进行详l表征—用共聚焦昑־镜获取原始细?yu)的三维数据、通过三维重构来数字化昄l胞(yu)形态，q用球形度来估计细?yu)Ş状。图5A展示了通过p焦显微镜获得的荧光{染活l胞(yu)状态。研Ih员发现拓扑微l构可以显著地改变细?yu)Ş态：?/span>S中，l胞(yu)受到严格U束Q因此细?yu)表面粗p（低球形度Q；?/span>L中，l胞(yu)松散地黏附在微井的底部和侧壁上，呈铺展Ş态（低球形度Q；而在M中，l胞(yu)适度黏附于微井，因此l胞(yu)于圆ŞQ高球Ş度）Q?/span>F上的l胞(yu)是四U基板中最q_的（球Ş度最低）。球度是用三l重建的数字信息计算的。细?yu)球度的l计l果分别?/span>0.54Q?/span>SQ?/span>0.65Q?/span>MQ?/span>0.59Q?/span>LQ和0.50Q?/span>FQ?/span>


?/span>5. 微柱?/span> RFP-hMSC l胞(yu)的三l表征?/span>(A) 三种微井阵列 (S?/span>M ?L)中和q面Q?/span>FQ上的细?yu)Ş态。从左到右的四行表示四种基板的示意图、共聚焦昑־镜典型结果、三l重构结果、准三维l胞(yu)黏附C意图。在p焦图片中Q红色表C用RFP标记的活l胞(yu)Q明C微柱阵列?/span>(B) l胞(yu)的球?(n?/span>80)?/span> ?/span> 6A昄?/span>在@环拉伸（1 HzQ?/span>10%Q期?/span>Q?/span>RFP-hMSCl胞(yu)?/span>扩散?/span>取向发生?/span>显著变化。图 6B ?/span>昄?/span>l胞(yu)铺展和取?/span>随时间变化的l计数据。在拉?/span>0-2时内，l胞(yu)?/span>S?/span>M?/span>L阵列中的铺展普遍降低Q?/span>减少5-8%Q，而在q面Q?/span>FQ?/span>上不明显Q减?/span>~1%Q?/span>可见Q?/span>一些细?/span>选择?/span>收羃成圆形ƈ黏附在微q侧壁上以避免物理扰动。在2-10时内，l胞(yu)的铺?/span>辑ֈEx，铺展?/span>分别?/span>39% (S)?/span>58% (M)?/span>53% (L)?/span>76% (F)?/span>


?/span>6. RFP-hMSCl胞(yu)在@环拉伸过E中?/span>铺展?/span>取向?/span> (A)循环拉后微?/span>阵列中细?yu)的昑־照片。底部的双箭头表C拉伸方向。荧光模式检带?/span>RFPQ红色荧光）标记的活l胞(yu)Q?/span>相差模式观察微柱阵列Q?/span>图中所昄的是合ƈ的图像?/span>Q?/span>BQ?/span>l胞(yu)的表?/span>铺展?/span>?/span>序参量随拉旉变化的结果，?/span>中的U线仅用于视觉引?/span>?/span>(C) 循环拉?/span>二维或准三维材料微环境中l胞(yu)状态的C意图?/span> 拉促l胞(yu)q移发生Ҏ(gu)性变化。从?/span>7Q?/span>上部Q显C的单细?yu)迁U轨q?/span>可以看出Q拉伸显?/span>改变了细?yu)迁U?/span>模式?/span>可见在拉伸过E中Q细?yu)感觉到强烈?/span>力学q扰Q?/span>?/span>Z避免扰动Q?/span>l胞(yu)选择?/span>拉的垂?/span>方向?/span>q移。此外，研究人员用轮?/span>q移速度和均方位U?/span> (MSD) 量化了细?yu)迁U?/span>?/span>轮廓q移速度?/span>q移长度 ( l ) 除以q移旉 ( t )得出Q详见图7左上角示意图Q?/span>Q?/span>
(1)

MSD 计算公式?/span>


(2)


或直接通过端到端向?/span>h 计算Q?/span>


(3)



其中D是扩散系数?/span>


MSD 随拉伸时?/span>tU性增加?/span>表明l胞(yu)q移遵@_子布朗q动的随机扩散方E。因此，可以使用 MSD 的结果计扩?/span>pLDQ如?/span>7?/span>?/span>所C?/span>不管?/span>拉q是非拉伸情?/span>Q?/span>微井阵列中细?yu)的扩?/span>pL大小序均ؓ M > L > S?/span>F的扩散率大于微井阵列Q因为细?/span>可以在没有微柱障的情况下迁UR拉伸和非拉伸的扩散pLQ?/span>D拉/ D非拉?/span>Qؓ S (0.5) < M (0.9) < L (1.6) < F (5.4)Q这意味着拉?/span>L?/span>F中的l胞(yu)q移速度变快Q而是S?/span>M中的l胞(yu)较慢?/span>l胞(yu)拉在很大程度上影响了细?yu)迁Uȝ方向。众所周知Q适度的细?yu)黏附可以促q细?yu)迁UR所以对于^坦表?/span> Q?/span>FQ和E疏微柱（LQ来_强烈的力学扰动（10% 拉 1 HzQ可能会削弱l胞(yu)黏附Q从而ɾl胞(yu)更适合q移。至于致密的微柱Q?/span>S?MQ，拉可以通过增加l胞(yu)牵引力来增强l胞(yu)黏附Q从而阻细?yu)迁UR?/span>
RFP-hMSCl胞(yu)在具有不同拓扑Ş貌表面的轮廓速度?/span>V拉= 10 ?m h-1 (S)?/span>29 ?m h-1 (M)?/span>24 ?m h-1 (L)?/span>76 ?m h -1 (F) ?/span>V非拉?/span>= 14 ?m h-1 (S)?/span>33 ?m h -1 (M)?/span>17 ?m h-1 (L)?/span>35 ?m h-1 (F)。在循环拉下细?yu)迁ULC出很强的方向性?/span>通过计算MSD?/span>X?/span>Y分量Q?/span>MSD X?/span>MSD Y Q，q将 MSD Y / MSD X定义为方向性，数?/span>?/span> 1.4 (S)?/span>5.1 (M)?/span>3.8 (L) ?17.2 (F)?/span>


?/span>7. 循环拉 (St.) 和非拉 (N.St.) 下单个细?yu)的跟踪路径?/span>图中昄了每个基板的30个细?yu)轨qV?/span>MSD是根据每1时q移轨迹的端到端距离计算得出的?/span>MSD?/span>X?/span>Y分量用于计算q移的方向?/span>?/span>
Z清楚地表征细?/span>与材料之间的怺联系Q?/span>研究人员?/span>hMSCl胞(yu)培养在二l_在^?/span>PDMS上）、准三维Q在PDMS微井中）和三l_?MatrigelQ微环境中。固定染色后Q在p焦显微镜下逐层扫描l胞(yu)。结果如?/span>8所C：黏着斑蛋白（vinculinQ?/span>?/span>微丝Q?/span>F-actinQ?/span>在所?/span>l度?/span>都很显著Q这说明l胞(yu)与材料之间存?/span>明显?/span>黏附位点?/span>其中研究人员发现Q?/span>?/span>三维微环境中的黏着斑蛋?/span>的荧光强度相对较?/span>Q这可能是由?/span>l胞(yu)与Y水凝胶的黏附较弱引v?/span>?/span>


?/span>8. p焦显微镜Z轴层扫的三维叠加图。其中灰色表C材料；U色表示微丝Q绿色表C黏着斑蛋白；蓝色表示l胞(yu)核。此处，?D?/span>表示q_ PDMS 表面上的l胞(yu)Q?/span>?D?/span>表示胶中的细?yu)?/span>?/span>quasi-3D?/span>表示?/span>PDMS微柱包围的微井中的细?yu)，其?/span>“S?/span>?/span>“M?/span>?/span>“L?/span>表示、中、大微井?/span> l胞(yu)?/span>二维和准三维中培?/span>4 hQ在三维中培?/span>24 h?/span> Z考察不同l胞(yu)对于三种微环境的响应Q将三种l胞(yu)在二l、准三维和三l微环境?/span>的细?yu)响应。这三种l胞(yu)分别?/span>hMSCQh骨髓间充质干l胞(yu)Q?/span>?/span>HFFQh包皮成纤l细?yu)?/span>?/span>HUVECQh脐静脉内皮细?yu)）。需要强调的是，q里q?/span>没有动用循环拉。图9A所C，l胞(yu)在二l?/span>微环境中4 h?/span>铺?/span>良好。但在三l?/span>微环?/span>?/span>管培养24 hQ细?/span>仍然在基质胶中趋于圆形。在准三l?/span>微环?/span>中，l胞(yu)表现Z同的形态：M使细?yu)?/span>S?/span>L膜更圆。图9B昄了定量分析的l果。圆度确实是二维<?/span>三维<三维。此外，每个l胞(yu)?/span>黏着斑蛋?/span>的积分强度ؓ二维: 准三l?/span>:三维= 5:3:1。因此，准三l微环境介于二维和三l之_?/span>相对更接q三l。在准三l_S?/span>M ?LQ中Q?/span>Ml在所有三cȝ?yu)的三个斚wQ?/span>微丝、圆度和l胞(yu)面积Q均昄出最高倹{?/span>



?/span>9. 在二l_PDMSq面上）、准三维Q?/span>PDMS 微井中）和三l_胶中Q微环境中培ȝ不同cd的细?yu)?/span>(A) 染色?/span>hMSC?/span>HFF?/span>HUVEC 的荧光显微照片，其中微丝为红Ԍ黏着斑蛋白ؓl色Q细?yu)核艌Ӏ?/span>(B)二维和准三维l胞(yu)培养 4 hQ三l细?yu)培?/span> 24 h?/span>微丝和黏着斑蛋白的U分强度和细?yu)黏附参数的l计l果?/span>
通过以上研究发现Q细?/span>在中{微?/span>Q?/span>MQ?/span>?/span>的取向、铺展?/span>q移均比微?/span> (S) 和大微井 (L)?/span>。由于细?yu)球度的序?/span> M > L > SQ研Ih员推准三维l胞(yu)黏附改变了细?yu)?/span>为。也是_M可能充当?/span>?/span>?/span>支架?/span>?/span>帮助l胞(yu)黏附、重新定向和q移。ؓ了进一步阐?/span>?/span>?/span>?/span>支架?/span>q一概念Q研Ih员将三种l胞(yu)用胰酶消化之后重(zhn)于l织培养?/span> (TCP) 表面20 分钟q行拍摄Q获得清晰的l胞(yu)昑־镜照片。经q细?yu)尺寸统计，研究人员得?/span>hMSC?/span>HFF?/span>HUVECl胞(yu)的直径分别ؓ16.6?2.5 μm?/span>20.7?5.4 μm?/span>17.2?2.0 μm。这三种人源l胞(yu)的尺寸确实均落在S微井?/span>M微井的直径范围内Q因此三U类型的l胞(yu)?/span>能在q入中微井后感应到适当的准三维微环境?/span>



?/span>10. hMSC?/span>HFF?/span>HUVEC l胞(yu)的直径（每组n ?100Q。图像是在细?yu)接U到l织培养?(TCP) 表面20 分钟后拍摄的。所有细?yu)的大小介?S ?M 微井的直径之间?/span> 该研I?/span>设计q成功制备了h可拉伸微l构的微控芯片Q在此基上构Zl胞(yu)的准三维黏附状态ƈq行循环拉刺激。细?/span>?/span>不同?/span>?/span>阵列中的循环拉使得l胞(yu)呈现不同水^的扩散?/span>取向、迁U速率和迁UL向性?/span>?/span>被聚合物微柱包围的中{微井引发了最强的l胞(yu)反应。研Ih员还研究了三U类型的l胞(yu)?/span>二维、准三维和三l微环境中的表现Q结果证实准三维微环?/span>介于二维和三l?/span>微环?/span>Q?/span>而且在许多方面，适当的准三维l胞(yu)可以模仿三维微环境中的细?yu)，同?/span>又能像在二维上一h便地观察。该研究为准三维微环?/span>?/span>l胞(yu)拉提供了有价值的工具Qƈ揭示了生物材料拓扑特征对l胞(yu)的复杂媄响，从而ؓ不同l度?/span>l胞(yu)研究开辟了新途径?/span>


原文链接

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X2100582X

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