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  質(zhì)粒DNA/聚陽(yáng)離子電解質(zhì)復(fù)合物納米顆粒是一類重要的非病毒基因遞送藥物載體。在對(duì)這類載體十?dāng)?shù)年的研究中，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控聚陽(yáng)離子電解質(zhì)的結(jié)構(gòu)，以及控制納米顆粒組裝的pH、溫度和溶劑極性等環(huán)境條件，可以從一定程度上實(shí)現(xiàn)對(duì)納米顆粒尺寸、形狀和表面性質(zhì)的調(diào)控。但由于這類納米藥物的組裝主要受動(dòng)力學(xué)（非熱力學(xué)）因素控制，而且是一個(gè)極快的過(guò)程、其組裝時(shí)間估計(jì)在數(shù)十毫秒數(shù)量級(jí)。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室制備方法，即通過(guò)機(jī)械方法簡(jiǎn)單混合質(zhì)粒DNA和聚陽(yáng)離子電解質(zhì)水溶液，無(wú)法實(shí)現(xiàn)組裝動(dòng)力學(xué)上的精確控制。這些因素造成所制備的納米顆粒的大小不均一、組分和性質(zhì)難以預(yù)測(cè)、且各批次產(chǎn)品很難重復(fù)。這些缺陷使此類納米藥物的結(jié)構(gòu)—性質(zhì)—功能關(guān)系還未得到系統(tǒng)的研究和闡釋，是這類納米藥物向臨床進(jìn)行轉(zhuǎn)化的一個(gè)主要技術(shù)瓶頸。

  為研究質(zhì)粒DNA/聚陽(yáng)離子電解質(zhì)復(fù)合物納米顆粒組裝的動(dòng)力學(xué)問(wèn)題，毛海泉教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一種快速納米復(fù)合方法（Flash Nanocomplexation, FNC），在受限沖擊射流反應(yīng)器（Confined Impinging Jet Mixer）內(nèi)以極高流速對(duì)沖質(zhì)粒DNA和聚陽(yáng)離子電解質(zhì)水溶液，以求在微觀尺度上控制組裝的動(dòng)力學(xué)條件。約翰–霍普金斯大學(xué)機(jī)械工程系Rajat Mittal教授團(tuán)隊(duì)以流體動(dòng)力學(xué)模擬的方法揭示在反應(yīng)器內(nèi)形成了尺寸微小的層狀分離結(jié)構(gòu)，通過(guò)縮小擴(kuò)散所需距離的方式將兩種物質(zhì)在分子尺度均勻混合的時(shí)間從傳統(tǒng)機(jī)械混合的數(shù)十秒縮小至約10毫秒。這一極短的混合時(shí)間已經(jīng)顯著短于此類納米藥物所需要的組裝時(shí)間，使分子尺度的混合在質(zhì)粒DNA開(kāi)始發(fā)生顯著折疊前完成。因此，動(dòng)力學(xué)濃度條件，即組裝時(shí)DNA和聚陽(yáng)離子電解質(zhì)的濃度被均一化，從而生產(chǎn)出大小均一、性質(zhì)相同且可調(diào)控的納米顆粒。

  該研究使用一種在臨床實(shí)驗(yàn)中普遍采用的線性聚乙烯亞胺in vivo-jetPEI作為模型聚陽(yáng)離子電解質(zhì)，通過(guò)對(duì)納米顆粒的組分研究，即測(cè)定單個(gè)納米顆粒的平均聚乙烯亞胺含量和質(zhì)粒DNA負(fù)載數(shù)。該研究成功制備了平均載量在只有1 個(gè)DNA/顆粒到50條DNA/顆粒的復(fù)合物納米顆粒。

圖1. 在受限沖擊射流反應(yīng)器內(nèi)的快速納米復(fù)合（FNC）方法示意圖（左）；在高分子理想溶液條件下實(shí)現(xiàn)的質(zhì)粒DNA組裝控制，實(shí)現(xiàn)從單質(zhì)粒納米顆粒到多質(zhì)粒納米顆粒制備的控制（右）。

  在隨后的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)此類納米藥物存在一最優(yōu)化的DNA負(fù)載量條件——均一的5至10個(gè)質(zhì)粒DNA/藥物顆�？稍陟o脈注射后在肺部產(chǎn)生最優(yōu)的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率。研究人員推測(cè)過(guò)少的質(zhì)粒DNA負(fù)載量導(dǎo)致過(guò)小的納米顆粒尺寸，可能不利于與細(xì)胞的相互作用；而過(guò)大的負(fù)載量導(dǎo)致相同劑量下產(chǎn)生的納米顆粒數(shù)量較少。使用這一優(yōu)化的負(fù)載量，和不經(jīng)動(dòng)力學(xué)控制制備的納米藥物載體相比，相同的遞送和轉(zhuǎn)染效率在更低的聚乙烯亞胺用量下就可以實(shí)現(xiàn)，與現(xiàn)行臨床實(shí)驗(yàn)的用量以及in vivo-jetPEI生產(chǎn)廠家的推薦用量相比可減少至少三分之一。這一用量的顯著減少極大改善了聚乙烯亞胺在靜脈注射后所可能產(chǎn)生的毒性，在實(shí)驗(yàn)所使用的小鼠模型中降低了極性肝毒性的風(fēng)險(xiǎn)。

  在進(jìn)一步的研究中，毛海泉教授與約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院放射科學(xué)系Martin G. Pomper和Il Minn教授合作，采用后者研發(fā)的含有癌癥特異性轉(zhuǎn)染表達(dá)啟動(dòng)子的質(zhì)粒DNA裝載納米藥物，實(shí)現(xiàn)了在肺癌細(xì)胞內(nèi)的特異基因表達(dá)。腫瘤模型小鼠（LL2肺癌及B16F10黑色素瘤肺部轉(zhuǎn)移）上的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了動(dòng)力學(xué)控制組裝的、低乙烯亞胺含量的納米顆粒藥物的優(yōu)異效果，這一優(yōu)化的劑型也將在未來(lái)用以開(kāi)發(fā)針對(duì)肺癌的特異性基因遞送療法。這些納米藥物可經(jīng)過(guò)優(yōu)化的凍干過(guò)程制備為粉末，并在較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間（9個(gè)月）內(nèi)保持穩(wěn)定性質(zhì)，使此類藥物被開(kāi)發(fā)為注射劑成為可能。

圖2. 動(dòng)力學(xué)控制制備的質(zhì)粒DNA/聚乙烯亞胺納米藥物的規(guī)模化凍干和快速?gòu)?fù)溶性質(zhì)，展示了優(yōu)異的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

  以上相關(guān)成果近期以“Kinetic Control in Assembly of Plasmid DNA/Polycation Complex Nanoparticles”為題目發(fā)表在期刊《ACS Nano》（doi.org/10.1021/acsnano.9b03334）上。論文的第一作者為約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院（JHUSOM）生物醫(yī)學(xué)工程系在讀博士生胡一宗，論文的共同通訊作者為JHUSOM放射科學(xué)系Il Minn教授，材料科學(xué)與工程系和生物醫(yī)學(xué)工程系雙聘教授毛海泉教授。

  論文鏈接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.9b03334