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  可視化觀察大腦的自然狀態(tài)是研究常見腦部疾病的重要方法。雙光子熒光（2PF）顯微成像因其激發(fā)波長在傳統(tǒng)的近紅外區(qū)（700-1000nm）和具有低的光漂白特性，通常被用于活體組織成像。然而，即使借助于顱窗，因激發(fā)光束在生物組織中的光散射，2PF成像技術(shù)也通常局限于淺層的生物組織成像。而且，由于失去了完整的顱骨，會導致術(shù)后動物存活率低。此外，對于大腦自然狀態(tài)的干擾和腦組織的發(fā)炎是不可避免的破壞性干擾因素，會導致腦血管成像質(zhì)量的降低。為了解決上述問題，三光子熒光（3PF）顯微成像作為一種有效的成像方式正在迅速的發(fā)展。與傳統(tǒng)的2PF成像方式不同，3PF成像利用近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-1700 nm）波段內(nèi)的激發(fā)光和更高階的非線性光學效應，這樣能夠顯著的提高了穿透深度、時間和空間分辨和信號背景比（SBR）。盡管擁有這些優(yōu)點，3PF成像的一個主要局限是缺乏具有大的三光子吸收截面和高熒光量子效率的有機染料。

  聚集誘導發(fā)光（AIE）的納米材料具有良好的抗光漂白性和生物兼容性等特點，近年來已有眾多AIE發(fā)光材料被制備出來。然而，大多數(shù)的材料是基于四苯乙烯（TPE）的骨架，擁有相對復雜的分子結(jié)構(gòu)，增加了AIE分子設(shè)計和化學合成的難度。因此，設(shè)計分子結(jié)構(gòu)簡單、易于合成的具有顯著三光子熒光特性的高效AIE生物熒光探針，仍然是一個挑戰(zhàn)。

  近日，中山大學材料科學與工程學院梁國棟課題組與浙江大學光電學院錢駿教授課題組和香港科技大學唐本忠院士團隊合作，設(shè)計并制備AIE熒光分子BTF。該AIE分子結(jié)構(gòu)簡單、合成簡便，具有典型的AIE特性、高的固態(tài)熒光量子產(chǎn)率（42.6%）和深紅/近紅外（FR/NIR）熒光。合成的BTF分子能夠通過納米沉淀的方法，制備成AIE點。AIE點具有良好的生物相容性、大的Stokes位移、高的光穩(wěn)定性和大的三光子吸收截面。BTF點作為有效的三光子熒光探針，可以對活體小鼠顱骨下血管進行三光子熒光成像。這是首次使用AIE點作為三光子熒光探針實現(xiàn)對完整顱骨下腦血栓過程的高穿透和高分辨的觀測。

  研究者設(shè)計的AIE染料BTF，它結(jié)構(gòu)中有強電子供體三苯胺（TPA）、叔丁基（t-Bu）基團和電子受體富馬腈（FN）。BTF具有典型的供體-受體（D-A）結(jié)構(gòu)，使分子具有FR/NIR發(fā)射和顯著的多光子吸收的能力。BTF可以溶解于常見有機溶劑中，但不溶于水。BTF在純THF中發(fā)出微弱的熒光。當在BTF的THF溶液中加入少量水（f_w≤50%）時，因為典型的扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（TICT）效應，BTF的發(fā)射紅移，強度減弱。隨著水含量的進一步增加（f_w≥60%），BTF分子由于疏水作用而形成納米聚集體，緩解了TICT效應，使AIE效應成為主導因素，導致BTF溶液的熒光強度增加。當溶液中f_w = 90%時，光譜強度達到最大值，是純THF溶液的5倍。因此，BTF是具有AIE特征的分子。

圖1. A）雙親性聚合物F127包覆BTF分子形成BTF點的制備過程示意圖。B）單光子熒光、三光子熒光和三次諧波產(chǎn)生過程示意圖。C）1550 nm飛秒激光激發(fā)下BTF點的水相分散液的三光子熒光和三次諧波光譜。插圖：毛細管內(nèi)BTF點水中分散液的三次諧波和三光子熒光成像圖。D）1550 nm飛秒激光激發(fā)下BTF點熒光強度和功率的依賴關(guān)系。E）1550 nm飛秒激光連續(xù)照射下不同時間點內(nèi)的三光子熒光強度變化情況。

  為了提高BTF分子在水中的分散性，使用雙親性聚合物F-127包覆形成BTF點（圖1A），聚集態(tài)量子產(chǎn)率為36.1%。BTF點在1550 nm飛秒（fs）激光激發(fā)下能夠激發(fā)出大約在650 nm處的三光子熒光和峰位在517 nm三次諧波信號（圖1B、C）。值得注意的是，三光子熒光信號比三次諧波信號強，波長更長，更有利于體內(nèi)深層組織成像（圖1B）。通過測試，BTF的三光子吸收截面為2.56×10^-79cm⁶s²。以1550 nm的激光連續(xù)照射40分鐘, BTF點在磷酸鹽緩沖液和水中的3PF強度保持在初始強度的90%以上（圖1E），這種良好的光穩(wěn)定性使得長時間的生物成像成為可能。

  因為BTF點的良好的生物相容性特征，研究者研究了以BTF點作為3PF探針，小鼠開顱情況下的腦血管3PF成像。得到了900 μm的小鼠腦血管成像深度和三維高分辨率腦血管重構(gòu)圖。此外，還觀察到在不同穿透深度產(chǎn)生的固有的三次諧波信號；并且三光子熒光信號與三次諧波信號良好匹配，可實現(xiàn)不同模式下的熒光成像，同時增加了生物成像的可信度。

圖2. A-C）具有完整顱骨的小鼠腦血管的活體三維高分辨率圖像，穿透深度為0至400 μm。D-F）沿（A）-（C）中黃線的橫截面強度剖面圖。腦血栓形成前（G，H）和后（I，J）腦血管的3PF圖像。K）沿（G）和（I）中黃線的橫截面強度剖面圖。L）通過3PF顯微成像技術(shù)，基于AIE點的完整顱骨腦血栓形成過程的可視化示意圖。

  基于3PF顯微成像技術(shù)和BTF點本身的優(yōu)勢，研究者在活體穿顱情況下實現(xiàn)了小鼠腦血管成像，得到了0-400 μm成像深度的高分辨3PF成像圖（圖2A-C）。通過該圖像，能夠清晰的觀測到小鼠腦部主要血管和微小毛細血管的空間網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。如圖2D-F所示，標記的毛細血管的半高寬在200，300和400 μm深度分別為0.95，1.59和2.08 μm。腦血栓是一種常見的腦部疾病，可導致急性腦損傷甚至死亡。因此，研究者進一步利用BTF納米點標記進行三光子熒光顯微成像，用于監(jiān)測完整顱骨小鼠的腦卒中過程。在大視場中可以觀查到血栓形成前后腦血管內(nèi)3PF信號的強烈變化（圖2G-J）。通過對3PF圖像中高亮線的定量分析，可以得出了同樣的結(jié)論。在正常狀態(tài)下，可以有效的監(jiān)測到來自腦血管的高達92.1的強烈的3PF信號（圖2H，K）。在小鼠腦中動脈堵塞形成后，由于血管缺血，在同一位置（圖2J，K），3PF強度顯著降低至1.1，已經(jīng)與背景信號難以區(qū)分。而在相同成像條件下，對照組小鼠中未觀測到腦血栓過程。因此，基于具有顯著非線性光學效應的超亮AIE點，研究者首次實現(xiàn)了高對比度、非侵入性的觀察完整顱骨的活體小鼠腦血栓的形成過程（圖2L）。這項研究將會有助于開發(fā)新的高效非線性發(fā)光染料，用于非侵入性活體生物腦成像的研究。

  以上研究成果以“Facile Synthesis of Efficient Luminogens with AIE Features for Three-Photon Fluorescence Imaging of Brain through Intact Skull”為題，近期發(fā)表在 Advanced Materials (Adv. Mater. 2020, 2000364) 上。中山大學秦瑋研究員和浙江大學博士、新疆醫(yī)科大學講師努爾尼沙·阿力甫為論文的第一作者，梁國棟教授、錢駿教授和唐本忠院士為通訊作者。該項研究得到了國家自然科學基金、中央高校基本科研業(yè)務費專項資金、浙江省自然科學基金、香港研究資助局和創(chuàng)新科技署等的資金資助。

  論文鏈接：https://www.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202000364