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  可視化觀察大腦的自然狀態(tài)是研究常見(jiàn)腦部疾病的重要方法。雙光子熒光（2PF）顯微成像因其激發(fā)波長(zhǎng)在傳統(tǒng)的近紅外區(qū)（700-1000nm）和具有低的光漂白特性，通常被用于活體組織成像。然而，即使借助于顱窗，因激發(fā)光束在生物組織中的光散射，2PF成像技術(shù)也通常局限于淺層的生物組織成像。而且，由于失去了完整的顱骨，會(huì)導(dǎo)致術(shù)后動(dòng)物存活率低。此外，對(duì)于大腦自然狀態(tài)的干擾和腦組織的發(fā)炎是不可避免的破壞性干擾因素，會(huì)導(dǎo)致腦血管成像質(zhì)量的降低。為了解決上述問(wèn)題，三光子熒光（3PF）顯微成像作為一種有效的成像方式正在迅速的發(fā)展。與傳統(tǒng)的2PF成像方式不同，3PF成像利用近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-1700 nm）波段內(nèi)的激發(fā)光和更高階的非線性光學(xué)效應(yīng)，這樣能夠顯著的提高了穿透深度、時(shí)間和空間分辨和信號(hào)背景比（SBR）。盡管擁有這些優(yōu)點(diǎn)，3PF成像的一個(gè)主要局限是缺乏具有大的三光子吸收截面和高熒光量子效率的有機(jī)染料。

  聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）的納米材料具有良好的抗光漂白性和生物兼容性等特點(diǎn)，近年來(lái)已有眾多AIE發(fā)光材料被制備出來(lái)。然而，大多數(shù)的材料是基于四苯乙烯（TPE）的骨架，擁有相對(duì)復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，增加了AIE分子設(shè)計(jì)和化學(xué)合成的難度。因此，設(shè)計(jì)分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于合成的具有顯著三光子熒光特性的高效AIE生物熒光探針，仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

  近日，中山大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院梁國(guó)棟課題組與浙江大學(xué)光電學(xué)院錢(qián)駿教授課題組和香港科技大學(xué)唐本忠院士團(tuán)隊(duì)合作，設(shè)計(jì)并制備AIE熒光分子BTF。該AIE分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、合成簡(jiǎn)便，具有典型的AIE特性、高的固態(tài)熒光量子產(chǎn)率（42.6%）和深紅/近紅外（FR/NIR）熒光。合成的BTF分子能夠通過(guò)納米沉淀的方法，制備成AIE點(diǎn)。AIE點(diǎn)具有良好的生物相容性、大的Stokes位移、高的光穩(wěn)定性和大的三光子吸收截面。BTF點(diǎn)作為有效的三光子熒光探針，可以對(duì)活體小鼠顱骨下血管進(jìn)行三光子熒光成像。這是首次使用AIE點(diǎn)作為三光子熒光探針實(shí)現(xiàn)對(duì)完整顱骨下腦血栓過(guò)程的高穿透和高分辨的觀測(cè)。

  研究者設(shè)計(jì)的AIE染料BTF，它結(jié)構(gòu)中有強(qiáng)電子供體三苯胺（TPA）、叔丁基（t-Bu）基團(tuán)和電子受體富馬腈（FN）。BTF具有典型的供體-受體（D-A）結(jié)構(gòu)，使分子具有FR/NIR發(fā)射和顯著的多光子吸收的能力。BTF可以溶解于常見(jiàn)有機(jī)溶劑中，但不溶于水。BTF在純THF中發(fā)出微弱的熒光。當(dāng)在BTF的THF溶液中加入少量水（f_w≤50%）時(shí)，因?yàn)榈湫偷呐で肿觾?nèi)電荷轉(zhuǎn)移（TICT）效應(yīng)，BTF的發(fā)射紅移，強(qiáng)度減弱。隨著水含量的進(jìn)一步增加（f_w≥60%），BTF分子由于疏水作用而形成納米聚集體，緩解了TICT效應(yīng)，使AIE效應(yīng)成為主導(dǎo)因素，導(dǎo)致BTF溶液的熒光強(qiáng)度增加。當(dāng)溶液中f_w = 90%時(shí)，光譜強(qiáng)度達(dá)到最大值，是純THF溶液的5倍。因此，BTF是具有AIE特征的分子。

圖1. A）雙親性聚合物F127包覆BTF分子形成BTF點(diǎn)的制備過(guò)程示意圖。B）單光子熒光、三光子熒光和三次諧波產(chǎn)生過(guò)程示意圖。C）1550 nm飛秒激光激發(fā)下BTF點(diǎn)的水相分散液的三光子熒光和三次諧波光譜。插圖：毛細(xì)管內(nèi)BTF點(diǎn)水中分散液的三次諧波和三光子熒光成像圖。D）1550 nm飛秒激光激發(fā)下BTF點(diǎn)熒光強(qiáng)度和功率的依賴(lài)關(guān)系。E）1550 nm飛秒激光連續(xù)照射下不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的三光子熒光強(qiáng)度變化情況。

  為了提高BTF分子在水中的分散性，使用雙親性聚合物F-127包覆形成BTF點(diǎn)（圖1A），聚集態(tài)量子產(chǎn)率為36.1%。BTF點(diǎn)在1550 nm飛秒（fs）激光激發(fā)下能夠激發(fā)出大約在650 nm處的三光子熒光和峰位在517 nm三次諧波信號(hào)（圖1B、C）。值得注意的是，三光子熒光信號(hào)比三次諧波信號(hào)強(qiáng)，波長(zhǎng)更長(zhǎng)，更有利于體內(nèi)深層組織成像（圖1B）。通過(guò)測(cè)試，BTF的三光子吸收截面為2.56×10^-79cm⁶s²。以1550 nm的激光連續(xù)照射40分鐘, BTF點(diǎn)在磷酸鹽緩沖液和水中的3PF強(qiáng)度保持在初始強(qiáng)度的90%以上（圖1E），這種良好的光穩(wěn)定性使得長(zhǎng)時(shí)間的生物成像成為可能。

  因?yàn)锽TF點(diǎn)的良好的生物相容性特征，研究者研究了以BTF點(diǎn)作為3PF探針，小鼠開(kāi)顱情況下的腦血管3PF成像。得到了900 μm的小鼠腦血管成像深度和三維高分辨率腦血管重構(gòu)圖。此外，還觀察到在不同穿透深度產(chǎn)生的固有的三次諧波信號(hào)；并且三光子熒光信號(hào)與三次諧波信號(hào)良好匹配，可實(shí)現(xiàn)不同模式下的熒光成像，同時(shí)增加了生物成像的可信度。

圖2. A-C）具有完整顱骨的小鼠腦血管的活體三維高分辨率圖像，穿透深度為0至400 μm。D-F）沿（A）-（C）中黃線的橫截面強(qiáng)度剖面圖。腦血栓形成前（G，H）和后（I，J）腦血管的3PF圖像。K）沿（G）和（I）中黃線的橫截面強(qiáng)度剖面圖。L）通過(guò)3PF顯微成像技術(shù)，基于AIE點(diǎn)的完整顱骨腦血栓形成過(guò)程的可視化示意圖。

  基于3PF顯微成像技術(shù)和BTF點(diǎn)本身的優(yōu)勢(shì)，研究者在活體穿顱情況下實(shí)現(xiàn)了小鼠腦血管成像，得到了0-400 μm成像深度的高分辨3PF成像圖（圖2A-C）。通過(guò)該圖像，能夠清晰的觀測(cè)到小鼠腦部主要血管和微小毛細(xì)血管的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。如圖2D-F所示，標(biāo)記的毛細(xì)血管的半高寬在200，300和400 μm深度分別為0.95，1.59和2.08 μm。腦血栓是一種常見(jiàn)的腦部疾病，可導(dǎo)致急性腦損傷甚至死亡。因此，研究者進(jìn)一步利用BTF納米點(diǎn)標(biāo)記進(jìn)行三光子熒光顯微成像，用于監(jiān)測(cè)完整顱骨小鼠的腦卒中過(guò)程。在大視場(chǎng)中可以觀查到血栓形成前后腦血管內(nèi)3PF信號(hào)的強(qiáng)烈變化（圖2G-J）。通過(guò)對(duì)3PF圖像中高亮線的定量分析，可以得出了同樣的結(jié)論。在正常狀態(tài)下，可以有效的監(jiān)測(cè)到來(lái)自腦血管的高達(dá)92.1的強(qiáng)烈的3PF信號(hào)（圖2H，K）。在小鼠腦中動(dòng)脈堵塞形成后，由于血管缺血，在同一位置（圖2J，K），3PF強(qiáng)度顯著降低至1.1，已經(jīng)與背景信號(hào)難以區(qū)分。而在相同成像條件下，對(duì)照組小鼠中未觀測(cè)到腦血栓過(guò)程。因此，基于具有顯著非線性光學(xué)效應(yīng)的超亮AIE點(diǎn)，研究者首次實(shí)現(xiàn)了高對(duì)比度、非侵入性的觀察完整顱骨的活體小鼠腦血栓的形成過(guò)程（圖2L）。這項(xiàng)研究將會(huì)有助于開(kāi)發(fā)新的高效非線性發(fā)光染料，用于非侵入性活體生物腦成像的研究。

  以上研究成果以“Facile Synthesis of Efficient Luminogens with AIE Features for Three-Photon Fluorescence Imaging of Brain through Intact Skull”為題，近期發(fā)表在 Advanced Materials (Adv. Mater. 2020, 2000364) 上。中山大學(xué)秦瑋研究員和浙江大學(xué)博士、新疆醫(yī)科大學(xué)講師努爾尼沙·阿力甫為論文的第一作者，梁國(guó)棟教授、錢(qián)駿教授和唐本忠院士為通訊作者。該項(xiàng)研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金、浙江省自然科學(xué)基金、香港研究資助局和創(chuàng)新科技署等的資金資助。

  論文鏈接：https://www.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202000364