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  在過(guò)去的幾十年中，人們一直致力于探索各種有效的臨床藥物篩選方法，以明確證明各種化學(xué)治療藥物的藥理學(xué)和毒理學(xué)特性�；诩�(xì)胞單層的傳統(tǒng)二維（2D）細(xì)胞培養(yǎng)方法已得到廣泛應(yīng)用，雖然操作簡(jiǎn)單，但在模擬高度復(fù)雜的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）微環(huán)境時(shí)具有一定的局限性，無(wú)法準(zhǔn)確反映體內(nèi)細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞-環(huán)境間的相互作用。為了克服這些局限性并得到能夠高度模擬體內(nèi)腫瘤特征的組織替代物，基于細(xì)胞聚集體的三維（3D）腫瘤模型已成為一種有前景的替代方法。

  華僑大學(xué)陳愛(ài)政教授課題組和哈佛醫(yī)學(xué)院Y. Shrike Zhang教授課題組基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA）多孔微球成功構(gòu)建三維肝癌模型，并研究該疾病模型在藥物篩選方面的應(yīng)用（圖1）。首先，利用微流體技術(shù)制造了PLGA的大多孔微球（PLGA PMs）。通過(guò)微流控技術(shù)制備的PLGA PMs平均粒徑為395 μm，擁有開(kāi)放且相互貫通的孔洞，孔徑為10-60 μm。然后，使用動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方法，通過(guò)在PLGA PMs中填充人肝癌細(xì)胞（HepG2）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），探索細(xì)胞組織聚集體的形成條件及腫瘤微組織的形成過(guò)程，構(gòu)建3D肝癌腫瘤微組織模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)5天后，分散性良好的微球之間開(kāi)始聚集，并在后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中形成組織團(tuán)塊。最后，利用該疾病模型用于評(píng)估各種化學(xué)治療抗癌藥，包括對(duì)于阿霉素（DOX）和順鉑（CIS）的細(xì)胞反應(yīng)。在相同培養(yǎng)時(shí)間下，細(xì)胞在3D培養(yǎng)條件下的IC₅₀值與傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)條件相比明顯更高，且結(jié)果具有顯著性差異，說(shuō)明3D培養(yǎng)下的細(xì)胞具有更好的抗藥性，構(gòu)建的腫瘤模型更加接近真實(shí)的腫瘤組織。

圖1 研究示意圖。

  為進(jìn)一步探究PLGA大多孔微球與HUVECs和HepG2細(xì)胞的相互作用以及肝癌組織的形成過(guò)程，將獲得的多孔微球混以HepG2和HUVECs，在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下觀察細(xì)胞的粘附情況及單分散性良好的微球之間因細(xì)胞相互作用而出現(xiàn)的微球間聚集及肝癌組織形成情況（圖2）。

圖2 血管化肝癌組織模型形成過(guò)程。黃色熒光標(biāo)記為HUVECs，紫色熒光標(biāo)記為HepG2。

  熒光染色結(jié)果表明，在共培養(yǎng)第一天時(shí)，細(xì)胞主要粘附在微球表面，內(nèi)部孔洞結(jié)構(gòu)分布了少量細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)到第2天時(shí)，微球內(nèi)部的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明細(xì)胞此時(shí)已經(jīng)進(jìn)入微球內(nèi)部，并保持著良好的活性。尤其是在第3天時(shí)，單分散性良好的微球由于細(xì)胞間的相互作用開(kāi)始靠近，形成“細(xì)胞橋梁”。在第5天時(shí)形成聚集體，細(xì)胞核染色結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了該實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）。另外，相比于2D培養(yǎng)條件下的HUVECs和HepG2，3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下的血管化肝癌模型中的細(xì)胞能夠分泌更多的白蛋白（Albumin）和多藥耐藥蛋白（MRP），說(shuō)明了組織形成及抗藥能力提升潛在的可能性。

圖3 （A）血管化肝癌組織模型形成過(guò)程及組織分泌（B）Albumin和（C）MRP分析。

圖4 DOX（紅色熒光）作用于（A）2D培養(yǎng)的細(xì)胞，及（B）動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下，（C-F）DOX作用于血管化肝癌組織模型不同時(shí)間藥物的積累情況分析

  以DOX為模型藥物，作者觀察了不同時(shí)間DOX在血管化肝癌模型中的積累情況（圖4）。由圖4A可以看出，在2D培養(yǎng)條件下，DOX在4 h時(shí)即可聚集在細(xì)胞內(nèi)部。而對(duì)于3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下的血管化肝癌模型（圖4B-F），在6 h時(shí)只能觀察到少量的紅色熒光，在繼續(xù)作用1 d后，DOX才逐漸進(jìn)入組織內(nèi)部。說(shuō)明利用PLGA PMs構(gòu)建的3D血管化肝癌模型能夠有效地延長(zhǎng)藥物進(jìn)入細(xì)胞的時(shí)間。另外，細(xì)胞活性分析結(jié)果表明，在相同培養(yǎng)時(shí)間下，細(xì)胞在3D培養(yǎng)條件下的IC50值明顯更高，且結(jié)果具有顯著性差異，說(shuō)明3D培養(yǎng)下的細(xì)胞具有更好的抗藥性，構(gòu)建的腫瘤模型更加接近真實(shí)的腫瘤組織。利用另一種模型藥物CIS重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，能夠得到類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明了該肝癌模型對(duì)于藥物篩選研究的普適性。綜上所述，以肝癌模型為例，可以通過(guò)同時(shí)負(fù)載HepG2及HUVECs體外培養(yǎng)形成血管化的肝癌組織，有利于構(gòu)建具有復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)、高度仿生的肝癌模型，與2D培養(yǎng)相比，可明顯提升細(xì)胞對(duì)DOX、CIS的抗藥性。該血管化肝癌模型將可用于更多的抗腫瘤藥物的篩選研究。

  以上相關(guān)成果以“Modeling Endothelialized Hepatic Tumor Microtissues for Drug Screening”為題，近期在線發(fā)表于《Advanced Science》。論文通訊作者為華僑大學(xué)陳愛(ài)政教授和哈佛醫(yī)學(xué)院Y. Shrike Zhang教授，華僑大學(xué)17級(jí)博士生王穎和Ranjith Kumar Kankala博士為共同第一作者。華僑大學(xué)王士斌教授、張建庭博士、郝瀏智碩士和復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院朱鎧博士為論文的共同作者。

  華僑大學(xué)部分的研究工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2018YFB1105600）、國(guó)家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合重點(diǎn)項(xiàng)目（U1605225）及福建省生物材料科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目的資助。

  論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202002002 

作者簡(jiǎn)介

  陳愛(ài)政：博士、教授、博士生導(dǎo)師。

  福建省優(yōu)秀教師，入選國(guó)家百千萬(wàn)人才工程、被授予“有突出貢獻(xiàn)中青年專家”榮譽(yù)稱號(hào)。目前擔(dān)任中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)理事、中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)復(fù)合材料分會(huì)秘書長(zhǎng)、中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)青年委員會(huì)委員、華僑大學(xué)生物材料與組織工程研究所所長(zhǎng)、福建省生物材料科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)帶頭人、福建省生物材料化工博士生導(dǎo)師團(tuán)隊(duì)帶頭人。主持國(guó)家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合重點(diǎn)項(xiàng)目、面上項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)子任務(wù)等國(guó)家級(jí)課題7項(xiàng)，及教育部博士點(diǎn)基金等省部級(jí)和其他課題累計(jì)10余項(xiàng)。主要從事超臨界流體技術(shù)及生物材料與組織工程領(lǐng)域的研究，已在AM, AFM, Small, JCR, CEJ, AHM, Biofabrication等期刊發(fā)表SCI收錄論文100余篇，獲授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利10余項(xiàng)。

  課題組網(wǎng)頁(yè)：https://www.x-mol.com/groups/hqubiomat

  Y. Shrike Zhang：博士，美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院助理教授，2013年于Georgia Institute of Technology生物醫(yī)學(xué)工程系取得博士學(xué)位。研究領(lǐng)域包括生物打印及器官芯片的平臺(tái)搭建與應(yīng)用研究，在相關(guān)領(lǐng)域發(fā)表研究論文及綜述200余篇，包括以第一或通訊作者發(fā)表的PNAS、Science、Nat. Rev. Mater.、Nat. Commun.、Adv. Mater.、ACS Nano、Angew. Chem. Int. Ed.、Biomaterials 等，其中超過(guò)40篇封面文章；研究成果曾被BBC、Fox News、The Boston Globe/STAT News、Science Daily、Technology Networks、IEEE Spectrum、C&EN、《科技日?qǐng)?bào)》等報(bào)道。擔(dān)任十余本雜志的主編、副主編和編委，曾獲得多種國(guó)際和地區(qū)性獎(jiǎng)項(xiàng)40余項(xiàng)。

  課題組網(wǎng)頁(yè)：https://shrikezhang.com/