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  近日，東華大學(xué)洪楓教授團隊利用簡便的液體施壓技術(shù)，將絲素蛋白納米顆粒（silk fibroin nanoparticles, SFNP）快速均一地引入到細(xì)菌納米纖維素（bacterial nanocellulose, BNC）小徑管內(nèi)壁纖維網(wǎng)絡(luò)，進一步固定后得到BNC-SFNP復(fù)合管，通過血液、細(xì)胞和動物皮下包埋等研究詳細(xì)評價了該復(fù)合管作為小徑人工血管的潛力。該成果以Improved Performance of Bacterial Nanocellulose Conduits by the Introduction of Silk Fibroin Nanoparticles and Heparin for Small-Caliber Vascular Graft Applications為題，作為封面文章（圖1）發(fā)表于Biomacromolecules（DOI: 10.1021/acs.biomac.0c01211）上。

圖1. 文章封面圖

  該方法巧妙地利用了BNC獨特的天然納米纖維網(wǎng)絡(luò)以及氫鍵在高壓水環(huán)境中不穩(wěn)定的特性。肝素（Hep）的引入試圖采用以下兩種方式（圖2）：一是將肝素包裹到SFNP中得到SF-HepNP顆粒，用于BNC-SF-HepNP復(fù)合管的構(gòu)建，另一種是將肝素化學(xué)接枝到SFNP上得到BNC-SFNP-Hep復(fù)合管。第一種方法中由于SF-HepNP整體粒徑較大，通過液體施壓技術(shù)僅使部分顆粒復(fù)合到纖維網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部。而第二種化學(xué)接枝的方法可以使肝素成功復(fù)合，并且得到的BNC-SFNP-Hep復(fù)合管具有優(yōu)異的抗凝血、促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖，以及抑制平滑肌細(xì)胞過度增生的性能，在小口徑人工血管中具有極大的應(yīng)用潛力。

圖2. 實驗設(shè)計示意圖。通過負(fù)載兩種絲素蛋白微球（SFNP）來制備基于BNC的小口徑人造血管，一種是肝素（Hep）包裹在微球中，另一種是化學(xué)接枝到微球表面；以純BNC、接枝肝素的BNC-Hep以及復(fù)合SFNP的BNC-SFNP為對照，評估血液、細(xì)胞以及組織相容性。

  據(jù)世界衛(wèi)生組織年度報告可知，心血管疾病（Cardiovascular diseases，CVD）已成為人類死亡的主要病因。血管重建在動靜脈病變、先天性畸形、血管腫瘤和血管支架植入后再閉塞等CVD臨床手術(shù)中占有重要地位。自體血管移植是血管重建手術(shù)中的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于供體來源有限、病人二次創(chuàng)傷等問題遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求。用滌綸或者膨體聚四氟乙烯材料制備而成的大口徑人工血管（內(nèi)徑大于或等于6 mm）已經(jīng)在臨床上廣泛使用，但是當(dāng)它們應(yīng)用于小口徑人工血管時（內(nèi)徑小于6 mm），卻由于血管栓塞、內(nèi)膜增生等問題一直未能成功，因此迄今市場上依舊沒有一款小口徑人工血管產(chǎn)品。由此可見，構(gòu)建具有長期暢通率的小口徑人工血管是目前研究的重點和難點。

  BNC由于獨特的納米三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、高純度以及良好的力學(xué)性能和生物相容性，被認(rèn)為在小口徑人工血管領(lǐng)域具有極好的應(yīng)用潛能。但是，純粹纖維素缺乏生物活性，不具有主動抗凝血以及顯著促進內(nèi)皮細(xì)胞黏附增殖的性能，而天然來源的絲素蛋白（silk fibroin, SF）具有促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖的功能，肝素則是臨床上廣泛使用的抗凝劑�，F(xiàn)有常規(guī)制備BNC基復(fù)合材料一般采用浸漬法，但是復(fù)合后的分子很容易爆釋，因此采用何種技術(shù)巧妙地將SF和肝素復(fù)合到BNC管中，成為了該研究的重點。

  針對以上問題，東華大學(xué)洪楓教授課題組設(shè)計開發(fā)了一種基于BNC納米三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特性的液體施壓技術(shù)（中國發(fā)明專利ZL201710948421.0和ZL201710949036.8），可將含有高分子、微納米材料（如SFNP）等的溶液壓入風(fēng)干板結(jié)的纖維網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部，快速充滿網(wǎng)絡(luò)孔隙的同時破壞板結(jié)纖維之間的氫鍵，從而恢復(fù)BNC三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進一步固定后即得到BNC基復(fù)合物。在最近的報道中，研究人員試圖通過此技術(shù)將兩種蛋白顆粒（SFNP和SF-HepNP）壓入纖維網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部，以期制備BNC-SFNP和BNC-SF-HepNP這兩種BNC基復(fù)合管。圖3顯示這兩種蛋白顆粒具有不同的尺寸，經(jīng)ImageJ統(tǒng)計可知，包裹了肝素的SF-HepNP直徑比未包的SFNP要大一倍以上。復(fù)合管產(chǎn)品設(shè)計示意圖如圖4所示。研究表明，由于SF-HepNP粒徑較大，進入BNC管壁的較少，而BNC-SFNP粒徑小，均一進入管壁后，利用蛋白上的氨基與肝素上的羧基形成酰胺鍵，進一步肝素化，得到BNC-SFNP-Hep（微觀結(jié)構(gòu)如圖5所示）。BNC-SFNP-Hep復(fù)合管具有優(yōu)異的抗凝血性能（結(jié)果如圖6所示），促進內(nèi)皮細(xì)胞黏附增殖以及抑制平滑肌細(xì)胞過度增殖的性能（結(jié)果如圖7所示），大鼠皮下植入后材料周圍幾乎沒有肉眼可見的炎癥，且H&E圖像顯示BNC-Hep和BNC-SFNP-Hep上沒有明顯的炎性細(xì)胞（圖8C），表明接枝肝素有利于減輕炎癥反應(yīng)。在BNC-SFNP管上觀察到最大的細(xì)胞浸潤，表明引入蛋白利于細(xì)胞的粘附增殖。早期炎癥有利于傷口愈合，而長期或過度的炎癥則是有害的。因此，研究中所有樣本的輕微炎癥可能是有益的。Masson的三色染色圖像表明細(xì)胞分泌產(chǎn)生了膠原，為組織再生提供了適宜的微環(huán)境。以上結(jié)果均表明BNC-SFNP-Hep在小口徑人工血管領(lǐng)域具有更好的應(yīng)用前景。

圖3 （a）DLS分析的微球直徑分布，（b）SFNPs和SF-HepNPs的SEM形貌，（c）ImageJ測量統(tǒng)計的微球直徑分布。

圖4. 產(chǎn)品設(shè)計示意圖，A為兩種SFNP顆粒的制備示意圖，B為合成BNC管的生物反應(yīng)器示意圖，C為BNC基復(fù)合管的制備過程示意圖。

圖5. BNC、BNC-SFNP、BNC-SF-HepNP、BNC-Hep和BNC-SFNP-Hep管材內(nèi)外表面在不同放大倍率下的顯微形貌（左：20000×；右：5000×）。

圖6 抗凝血性研究，a為溶血率，b為血小板黏附，c為血漿復(fù)鈣動力學(xué)研究，d、e、f分別為c對應(yīng)的血漿復(fù)鈣時間、起點和終點吸光度值。

圖7. 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性（Ⅰ）、活死細(xì)胞熒光染色及SEM觀察（Ⅲ），人平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞毒性（Ⅱ）、細(xì)胞骨架染色和SEM觀察（Ⅳ）。

圖 8. BNC、BNC-SFNP、BNC-Hep以及BNC-SFNP-Hep管在大鼠皮下移植前（A）和4周后（B）的宏觀形態(tài)；H&E（C）和Masson三色（D）染色圖像。第4行和第6行是第3行和第5行中黃色矩形內(nèi)組織的放大視圖；材料和組織的大致邊界用黃色虛線標(biāo)出，*表示材料一側(cè)。

  論文第一作者為東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院博士生包露涵，通訊作者為細(xì)菌納米纖維制造及復(fù)合技術(shù)科研基地的洪楓教授。該研究得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金和東華大學(xué)博士研究生創(chuàng)新基金的資助。

  全文下載鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.biomac.0c01211

  該研究團隊長期從事細(xì)菌纖維素的低成本高效制備及其高附加值醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究（https://www.researchgate.net/profile/Feng_Hong2），包括在細(xì)菌纖維素基小口徑人工血管、神經(jīng)導(dǎo)管、止血海綿、載藥纖維素緩釋凝膠、功能敷料等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開展了大量工作。

  BNC基小口徑人工血管研究領(lǐng)域，該團隊于國際上首次提出并構(gòu)建了“雙硅膠管”生物反應(yīng)器用于高效生產(chǎn)一體化管狀BNC材料¹，研究比較了不同反應(yīng)器制備BNC管的培育歷程，揭示了BNC合成過程中的溶氧和菌體分布，以及不同培養(yǎng)條件對BNC管的結(jié)構(gòu)和性能的影響²，并詳細(xì)比較了國內(nèi)外三種生物反應(yīng)器制備得到的BNC管的結(jié)構(gòu)和性能差異³。以BNC管為基底材料，制備了BNC-PVA^4，5、肝素化的BNC-殼聚糖⁶、BNC-明膠⁷等一系列復(fù)合管，分別在力學(xué)性能、抗凝血性、生物活性等方面進行改善，以進一步提升應(yīng)用于小口徑人工血管的潛力。最近，該團隊為解決BNC凝膠管儲存貨架周期短和手術(shù)縫合操作難等問題，在國際上又率先評價了風(fēng)干細(xì)菌纖維素小徑管在兔頸動脈模型中的替換應(yīng)用情況⁸。

1. Preliminary study on biosynthesis of bacterial nanocellulose tubes in a novel double-silicone-tube bioreactor for potential vascular prosthesis. BioMed Research International, 2015, 2015, 560365.

2. Comparison of two types of bioreactors for synthesis of bacterial nanocellulose tubes as potential medical prostheses including artificial blood vessels. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2017, 92, 1218-1228.

3. Physicochemical properties and in vitro biocompatibility of three bacterial nanocellulose conduits for blood vessel applications. Carbohydrate Polymers, 2020, 239, 116246.

4. Potential of PVA-doped bacterial nano-cellulose tubular composites for artificial blood vessels. Journal of Materials Chemistry B, 2015, 3, 8537-8547.

5. 細(xì)菌納米纖維素/聚乙烯醇小徑人工血管的制備及其表征. 中國組織工程研究, 2017, 21(34), 5474-5480.

6. Performance improvements of the BNC tubes from unique double-silicone-tube bioreactors by introducing chitosan and heparin for application as small-diameter artificial blood vessels. Carbohydrate Polymers, 2017, 178, 394-405.

7. 肝素/魚源明膠改性細(xì)菌納米纖維素管用于小口徑人工血管的潛力. 纖維素科學(xué)與技術(shù), 2019, 27(2), 1-10.

8. Implantation of air-dried bacterial nanocellulose conduits in a small-caliber vascular prosthesis rabbit model.  Materials Science & Engineering C, 2021, 122, 111922