膠原蛋白為細胞外基質(zhì)(ECM)的核心成分，是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的骨架，支撐細胞功能表達的平臺，并具備促進組織再生和修復(fù)的性能，在組織工程中得到了廣泛的應(yīng)用，如傷口愈合、骨骼和神經(jīng)再生等。 遺憾的是，膠原天然的致血栓特性極大地限制了其在心血管植介入材料及器械（血管支架、人工心臟瓣膜、心臟封堵器等）中應(yīng)用的可能性。
人III型膠原蛋白序列中，有正負電荷相鄰排列的GER（甘氨酸-谷氨酸-精氨酸）或GEK（甘氨酸-谷氨酸-賴氨酸）等能有效促細胞粘附的三元片段，細胞粘附是由整合素與多肽結(jié)合介導(dǎo)的。 膠原蛋白通過受體GP Ia/IIa (α2β1)， GP VI和GP Ib/IX/V復(fù)合物激活血小板，受體α2β1的I域識別并結(jié)合膠原蛋白序列GFOGER, GLOGER, GROGER, GLOGEN等，導(dǎo)致嚴重的血小板粘附和激活。 這些序列顯示片段中的羥脯氨酸(O)可能對血小板粘附和活化至關(guān)重要。 因此，通過對人的III型膠原蛋白序列進行計算機輔助篩選設(shè)計，獲取含有高細胞黏附活性片段、不含有血小板結(jié)合位點的序列，可能是獲得一類可用于心血管材料改性的定制化新型重組人源化膠原蛋白材料的有效方案。
王云兵教授團隊與復(fù)旦大學(xué)等緊密合作，系統(tǒng)研究了人III型膠原蛋白全序列，篩選出了人III型膠原蛋白全序列中的Gly483-Pro512區(qū)段，該序列既保留了高黏附性的片段（GER、GEK）,又避開了含有羥脯氨酸(O) 的片段T16WTp（483GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP512 ）。表1和圖1分別為研究團隊所開展的抗凝多肽的序列研究，結(jié)果表明T16WTp具有極低的血小板親和力，基于該片段合成的重組III型人源化膠原蛋白（hCOLIII）具有抗血小板黏附和激活的作用。研究團隊基于hCOLIII的抗血栓特性，在血管支架表面構(gòu)建了基于重組人源膠原蛋白的仿細胞外基質(zhì)涂層，與動物膠原蛋白(aCOL)相比，定制化hCOLIII仿生涂層的具有優(yōu)異的抗凝血性能（圖2），能有效的促進體外內(nèi)皮細胞的增殖，同時能促進平滑肌細胞由分泌型向收縮型轉(zhuǎn)化，從而抑制平滑肌細胞增殖（圖3）。支架植入動物實驗表明，基于重組III型人源化膠原蛋白構(gòu)建的心血管支架涂層具有優(yōu)異的抑制炎癥反應(yīng)、抑制過度的新生內(nèi)膜增生、促血管組織內(nèi)皮化和抗血栓形成的作用（圖4）。該項工作挖掘了定制化膠原基材料用于心血管植介入材料制備和改性的潛能，為心血管植介入材料和器械的研究提供新的技術(shù)儲備和研發(fā)思路。
表1 篩選設(shè)計的6種衍生于人源III型膠原蛋白的多肽氨基酸序列
圖1篩選設(shè)計的6種衍生于人源III型膠原蛋白的多肽在聚乳酸（PLA）材料上的血小板粘附與激活SEM結(jié)果及重組III型人源化膠原蛋白（hCOLIII）與動物膠原蛋白(aCOL)在PLA材料上的血小板粘附與激活SEM結(jié)果
圖2. （A）基于動物膠原aCOL和重組人源化膠原蛋白hCOLIII制備的涂層血小板粘附/激活;（B）基于重組人源膠原的細胞外基質(zhì)仿生支架涂層半體內(nèi)血液循環(huán)實驗--新西蘭白兔半體內(nèi)試驗?zāi)Ｐ停?/span>（C）為半體內(nèi)循環(huán)后在樣品表面血栓沉積照片；（D）不同導(dǎo)管的封堵率；(E)為不同樣品表面血液循環(huán)2h后的SEM結(jié)果
圖3. (A)不同樣品培養(yǎng)1天和3天后ECs熒光染色; (B)不同樣品培養(yǎng)1天和3天后SMCs的熒光染色；(C)不同樣品ECs的細胞活力；(D) 不同樣品SMCs的細胞活力 ；(E)Western Blotting細胞骨架蛋白表達分析，包括SM22a、α-SMA、MMP-2、MMP-9; (F) α-SMA、SM22a、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達量分析。
圖4. （A）對植入支架周圍組織進行HE、CD68、α-SMA免疫組化染色分析；(B)血管狹窄率; (C) 不同組織的炎癥評估; (D)組織中α-SMA的相對強度; (E)組織內(nèi)部的SEM圖; (F) CD31 表達；(G)新生內(nèi)膜表面eNOS表達; (H, I) CD31和eNOS在新生內(nèi)膜表面的定量分析。
以上相關(guān)成果發(fā)表在Biomaterials（Biomaterials ，276 (2021) ，121055）。論文第一作者為四川大學(xué)國家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心楊立老師，通訊作者為國家中心主任王云兵教授和羅日方副研究員。
論文鏈接：https://authors.elsevier.com/a/1dXOwWWN0osjL
四川大學(xué)王云兵教授團隊主頁：https://m.x-mol.com/groups/wang_yunbing
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