細胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)在基因的調(diào)控、翻譯和表達的過程中扮演著重要的角色，常與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及耐藥性有關(guān)。但核蛋白被細胞膜和核膜的雙重屏障包圍，實際檢測中，面臨比細胞質(zhì)蛋白檢測更多困難。常規(guī)蛋白質(zhì)免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附實驗和免疫沉淀法均需要將細胞裂解，無法滿足活細胞實時檢測。而活細胞狀態(tài)下檢測細胞核蛋白主要方法，如分子熒光染料法和質(zhì)粒表達法，需要特定篩選條件而缺乏一定的適用性，不能滿足需求內(nèi)源核蛋白的精準(zhǔn)檢測。
近日，北京航空航天大學(xué)常凌乾課題組在《Biosensors and Bioelectronics》上發(fā)表了題為“Companion-Probe & Race Platform for Interrogating Nuclear Protein and Migration of Living Cells”的研究論文。該工作設(shè)計了一種新型分析生物芯片平臺(CPR)，能在活細胞中探測核蛋白，同時實時追蹤細胞的遷移；該芯片結(jié)合納米電穿孔技術(shù)（課題組標(biāo)簽技術(shù)），將一種攜帶有識別細胞核內(nèi)蛋白特異性識別肽的相伴型組合探針遞送進活細胞核內(nèi)，到檢測到靶蛋白后產(chǎn)生綠色熒光。為了追蹤活細胞的遷移，作者在平臺上設(shè)計了多個帶有標(biāo)志點的放射狀微通道，作為細胞的可尋址跑道。通過記錄細胞在一定時間內(nèi)經(jīng)過的標(biāo)志點的數(shù)量，可以監(jiān)測細胞的遷移距離和估計遷移速度(圖1)。
圖1. 用于探測活細胞核內(nèi)蛋白和遷移行為的CPR平臺原理圖
作者將40個標(biāo)記點定義為四個部分，從細胞內(nèi)探測區(qū)域的邊緣（起點）到微通道的靜脈孔，每十個標(biāo)記點設(shè)為一組間隔。課題選擇與細胞遷移率相關(guān)的MDM2蛋白作為檢測蛋白，其表達水平與細胞遷移速度呈正相關(guān)。綜合分析結(jié)果顯示，45%以上的MDM2蛋白過表達的細胞遷移到20號-40號微標(biāo)記，而對照組細胞只在20號微標(biāo)記內(nèi)遷移，表明MDM2蛋白過表達的細胞的遷移能力增強。作者根據(jù)在遷移觀察區(qū)移動的時間和細胞的遷移距離估計了這些細胞的遷移速度，并驗證了MDM2蛋白過表達的細胞的速度明顯快于對照細胞。通過CPR平臺和MATLAB軟件計算的遷移速度具有可比性，證明了CPR平臺在一定時期內(nèi)通過簡單地計算標(biāo)記點來評估細胞遷移速度的可行性。根據(jù)MDM2蛋白表達和細胞遷移速度的關(guān)系分析，MDM2蛋白的表達水平與細胞遷移速度呈正相關(guān)關(guān)系(圖2)。這一結(jié)果與報道的MDM2蛋白高表達促進腫瘤遷移的研究一致。
圖2. 細胞遷移分析的CPR平臺
為評估CPR平臺的多功能性，作者在CPR平臺上分析了六個原發(fā)性肺腫瘤細胞樣本(T1-T6)和六個原發(fā)性正常肺細胞樣本(N1-N6)細胞核內(nèi)MDM2表達。在所有六個原發(fā)性肺腫瘤細胞的細胞核中都觀察到明顯的綠色熒光，表明MDM2蛋白在腫瘤細胞中的高表達。研究發(fā)現(xiàn)，相同時間內(nèi)，原發(fā)性肺腫瘤細胞比原發(fā)性正常肺細胞遷移得更遠 (圖3)。原代細胞的成功檢測顯示了CPR平臺在分析不同來源的細胞樣本方面的高度通用性。
圖3. 用于跟蹤原代細胞遷移的CPR平臺
該研究第一單位為北京市生物醫(yī)學(xué)工程高精尖創(chuàng)新中心和北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院。常凌乾教授為主要通訊作者。第一作者為孫宏博士、董再再博士和張清洋博士。文章的其他主要共同作者包括，中國科學(xué)院大學(xué)深圳先進技術(shù)研究院任培根研究員，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院吳楠教授。
文章鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566322003219
