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東華大學沈明武/史向陽教授團隊 ACS Nano：生物活性的含磷樹狀大分子作為通用型蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)用于增強的抗炎治療
2024-01-12  來源：高分子科技

  蛋白類藥物因其高特異性和低副作用而越來越被認為是藥物開發(fā)和疾病治療領(lǐng)域中有希望的候選者。然而，大多數(shù)蛋白質(zhì)由于分子量大、膜滲透性差、易被酶降解等特點而難以穿過細胞膜并作用于細胞內(nèi)疾病靶點。因此，開發(fā)針對細胞內(nèi)疾病靶點的簡單高效的蛋白質(zhì)遞送技術(shù)是擴大蛋白質(zhì)藥物應用場景的重要途徑。


  一般來說，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)遞送的策略包括物理方法（如電穿孔、納米針、微流控和T細胞介導的孔形成）或化學方法（如蛋白質(zhì)與細胞穿透肽、轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域、兩親性小分子等滲透性模塊的共價結(jié)合）。盡管這些細胞內(nèi)遞送蛋白質(zhì)的方法有效，但也存在不可忽視的缺點，包括依賴于苛刻的設備條件、蛋白質(zhì)化學修飾需要花費額外的時間和費用、細胞活力受損、蛋白質(zhì)活性降低、內(nèi)涵體逃逸效率差等。在這種情況下，基于非共價相互作用的納米載體，如脂質(zhì)體、納米凝膠、外泌體和聚合物為有效的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)遞送提供了更多的選項。


  在眾多的納米載體體系中，表面修飾磷酯酸鈉鹽的陰離子型含磷樹狀/樹冠大分子具有特定的生物活性，如抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進NK細胞增殖等特性。因此，各種基于含磷樹狀/樹冠大分子的納米平臺已被構(gòu)建用于化療藥物的胞內(nèi)遞送。其中，陽離子型含磷樹狀大分子、PAMAM、PEI等高分子載體與蛋白質(zhì)的相互作用已被報道并被應用到蛋白質(zhì)的胞內(nèi)遞送中。然而，考慮到高密度的正電荷可能會導致不可預測的細胞毒性，因此，依賴負電荷遞送蛋白質(zhì)到細胞內(nèi)的必要性需要重新評估。此外，大量載體的不合理使用所導致的代謝和清除不良，也可能引發(fā)機體毒性。因此，開發(fā)基于具有固有免疫調(diào)節(jié)活性的陰離子型含磷樹狀大分子的蛋白質(zhì)胞內(nèi)遞送載體有望解決以上問題，并可通過載體和蛋白質(zhì)的功能協(xié)同發(fā)揮增強的治療效果。


  為了解決以上問題，東華大學沈明武/史向陽教授團隊與法國國家科學研究中心Jean-Pierre Majoral院士團隊合作構(gòu)建了一種基于亞磷酸鈉鹽封端的含磷樹狀大分子的蛋白質(zhì)胞內(nèi)遞送載體（圖1）。研究團隊首先采用發(fā)散迭代法合成了5種分支中不含可水解的C=N-N-Me片段的含磷樹狀大分子，并篩選出抗炎活性和蛋白質(zhì)遞送性能最優(yōu)的含磷樹狀大分子AK-137。AK-137可通過各種物理相互作用與蛋白質(zhì)（包括牛血清白蛋白（BSA）、核糖核酸酶A（RNase A）、卵清蛋白（OVA）和纖連蛋白（FN））復合實現(xiàn)多種功能蛋白的細胞內(nèi)遞送以發(fā)揮各自的生物學功能，并利用載體自身免疫調(diào)節(jié)活性與所遞送的纖連蛋白之間的協(xié)同作用在急性肺損傷和急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型中實現(xiàn)了增強的抗炎治療效果。 


圖1. 含磷樹狀大分子AK-137通過各種物理相互作用與蛋白質(zhì)絡合用于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的遞送。


  研究團隊首先通過核磁共振氫譜、碳譜和磷譜證明了不同含磷樹狀大分子以及中間產(chǎn)物的成功合成（圖2A）。其中，含磷樹狀大分子AK-137表現(xiàn)出最為優(yōu)異的免疫調(diào)節(jié)性能，包括增加巨噬細胞表面CD206的表達、誘導巨噬細胞群體從M1表型極化至M2表型（圖2B-D）、抑制促炎性介質(zhì)亞硝酸鹽的釋放（圖2E）。重要的是，AK-137對模型蛋白BSA的細胞內(nèi)遞送能力也高于其他含磷樹狀大分子（圖2F）。 


圖2.（A）不同含磷樹狀大分子的結(jié)構(gòu)圖；（B-D）流式細胞術(shù)分析不同含磷樹狀大分子處理RAW264.7細胞后細胞表面CD86和CD206的表達變化；（E）含磷樹狀大分子抑制RAW264.7細胞釋放亞硝酸鹽的能力；（F）不同含磷樹狀大分子胞內(nèi)遞送BSA的效率。


  基于以上發(fā)現(xiàn)，研究團隊選擇了具有最佳抗炎活性和蛋白質(zhì)遞送性能的含磷樹狀大分子AK-137進行下一步研究。以BSA為模型蛋白，探討AK-137的蛋白結(jié)合行為。動態(tài)光散射結(jié)果顯示當含磷樹狀大分子AK-137與BSA的質(zhì)量比為12：1時，獲得的復合物具有合適的水合粒徑尺寸、表面電勢以及最小的聚合分散系數(shù)（圖3A-B）。同時，在此質(zhì)量比下，AK-137可以有效誘導BSA的聚集，從而導致Cy5.5-BSA熒光信號的顯著猝滅（圖3C）。TEM圖像顯示獲得的AK-137@BSA nanocomplexes (NCs) 具有尺寸大小為108.3 nm的均勻球形結(jié)構(gòu)（圖3D）。另外，AFM圖像顯示AK-137和AK-137@BSA NCs間顆粒高度的差異也進一步證明了復合物的成功制備（圖3E-F）。所獲得的AK-137@BSA NCs具有良好的穩(wěn)定性（圖3G），并主要通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用促進BSA的胞內(nèi)遞送（圖3H-K）。 


圖3.（A-B）AK-137與BSA在不同質(zhì)量比下的水合粒徑和表面電勢；（C）Cy5.5-BSA的熒光發(fā)射光譜；（D）AK-137@BSA NCs的TEM圖像；（E-F）AK-137和AK-137@BSA NCs的AFM圖和相應高度圖；（G）AK-137@BSA NCs一周內(nèi)的水合粒徑變化；（H-I）AK-137@BSA NCs細胞內(nèi)攝取的流式圖和CLSM圖像；（J-K）不同內(nèi)吞抑制處理的細胞對AK-137@BSA NCs攝取水平的變化。


  研究團隊進一步驗證了AK-137促進其他功能蛋白胞內(nèi)遞送的能力。流式和CLSM結(jié)果顯示，AK-137可以有效的促進細胞毒性蛋白RNase A、模型抗原OVA、抗炎性蛋白FN的胞內(nèi)遞送（圖4A-D）。AK-137@RNase A組細胞凋亡水平顯著高于單獨的RNase A，這意味著AK-137@RNase A NCs能夠有效地在細胞內(nèi)遞送RNase A以降解RNA，從而誘導增強的抗癌細胞毒性（圖4E-F）。同時，AK-137介導的OVA胞內(nèi)遞送促進樹突細胞的熟化，有望用于潛在的抗腫瘤免疫治療應用（圖4G-H）。 


圖4.（A-D）不同細胞攝取AK-137@RNase A、AK-137@OVA和AK-137@FN的流式圖和CLSM圖像；（E-F）不同材料處理HeLa細胞后細胞凋亡水平的變化；（G-H）不同材料處理樹突細胞后細胞表面CD80和CD86表達水平的變化。
研究團隊進一步探究了FN的胞內(nèi)遞送產(chǎn)生的生物學效應。巨噬細胞極化實驗顯示AK-137和FN均能在一定程度上誘導巨噬細胞群體從M1表型向M2表型極化，但是效果是有限的。AK-137@FN NCs在AK-137和FN的協(xié)同以及增強的FN胞內(nèi)遞送效果的共同作用下表現(xiàn)出最低的CD86水平和最高的CD206水平（圖5A-C）。同時，AK-137@FN NCs也可以有效促進巨噬細胞中Arg-1水平的升高，抑制iNOS的表達（圖5D），有效促進巨噬細胞向抗炎M2表型的極化。另外，AK-137通過促進FN的細胞內(nèi)遞送進一步放大了FN的抗氧化能力，有效降低細胞內(nèi)ROS水平（圖5E-F）。得益于AK-137@FN NCs優(yōu)異的免疫調(diào)節(jié)活性和抗氧化性能，LPS激活的巨噬細胞內(nèi)的促炎性細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的表達水平也被有效降低，并且這種抗炎性能可能是通過抑制PI3K/Akt和NF-κB信號通路實現(xiàn)的（圖5G-J）。 


圖5.（A-C）不同材料處理后MH-S細胞表面CD86和CD206表達水平的流式檢測結(jié)果；（D）不同材料處理后MH-S細胞中Arg-1和iNOS的表達水平；（E-F）不同材料處理后MH-S細胞中ROS水平變化；（G-I）qPCR分析不同材料處理后細胞內(nèi)促炎性細胞因子的相對mRNA表達水平；（J）Western blot分析不同材料處理后MH-S細胞中p-Akt和NF-κB的表達水平。


  受AK-137@FN NCs在體外強大的抗炎活性的啟發(fā)，研究團隊構(gòu)建了急性肺損傷（ALI）小鼠模型驗證AK-137@FN NCs的體內(nèi)抗炎治療效果（圖6A）。通過檢測不同治療組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子的表達證明AK-137@FN NCs能夠抑制ALI小鼠肺組織中過度的細胞因子風暴，并升高抗炎性細胞因子IL-10的表達水平（圖6B-E）。進一步的實驗結(jié)果表明，AK-137@FN NCs可通過緩解細胞因子風暴抑制中性粒細胞對肺組織的侵襲（圖6F-H），從而有效避免中性粒細胞釋放的蛋白水解酶和氧化產(chǎn)物進入肺組織引起肺水腫和肺損傷（圖6I-J），對急性肺損傷小鼠表現(xiàn)出優(yōu)異的治療效果。 


圖6.（A）ALI小鼠體內(nèi)抗炎治療示意圖。（B-E）不同材料治療后ALI小鼠BALF中促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）和抗炎因子IL-10的表達水平。（F-H）不同組ALI小鼠治療24 h后肺組織中性粒細胞百分比和BALF中中性粒細胞生物標志物MPO的表達水平。（I-J）不同處理組ALI小鼠肺干濕重比和肺損傷評分。


  研究團隊進一步通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射尿酸鈉（MSU）晶體構(gòu)建急性痛風性關(guān)節(jié)炎（AGA）小鼠模型以評價AK-137@FN NCs在抗炎治療中的適用性（圖7A）。體內(nèi)結(jié)果顯示，AK-137@FN NCs治療組可以抑制AGA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹以及紅腫發(fā)熱等情況，減緩了AGA小鼠關(guān)節(jié)腔變小、關(guān)節(jié)腔液體滲出、炎癥細胞侵襲等病理特征（圖7B-D）？紤]到MSU晶體在關(guān)節(jié)內(nèi)的積累可通過激活巨噬細胞中NLRP3炎癥小體和NF-κB信號通路，促進IL-1β和IL-18等炎癥介質(zhì)的分泌，從而誘導關(guān)節(jié)炎癥這一事實。我們進一步的AGA小鼠踝關(guān)節(jié)TNF-α和IL-1β的免疫熒光染色結(jié)果顯示，AK-137@FN NCs顯著抑制了踝關(guān)節(jié)病灶部位TNF-α和IL-1β的表達（圖7E-F），明顯優(yōu)于單獨的載體和蛋白質(zhì)藥物，具有良好的體內(nèi)抗炎活性。 


圖7.（A）AGA體內(nèi)抗炎治療示意圖。（B-C）不同材料處理后AGA小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度和踝關(guān)節(jié)代表性熱像圖。（D）不同材料處理后AGA小鼠踝關(guān)節(jié)的H&E染色。（E-F）不同材料處理后AGA小鼠踝關(guān)節(jié)組織TNF-α和IL-1β的免疫熒光染色。


  簡而言之，該研究設計的基于含磷樹狀大分子的蛋白質(zhì)遞送平臺具有多個優(yōu)勢：1）合成了具有固有免疫調(diào)節(jié)活性、穩(wěn)定的含磷樹狀大分子；2）提供了一種“簡單、有效和非侵入性”的蛋白質(zhì)遞送策略，不需要對載體和蛋白質(zhì)進行額外的功能修飾；3）含磷樹狀大分子AK-137通過促進功能蛋白的細胞內(nèi)遞送改善了其生物利用度，可在不同的靶細胞內(nèi)發(fā)揮各自的功能，包括癌細胞凋亡、樹突細胞成熟或巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)等；4）構(gòu)建的AK-137@FN復合物通過增強FN的胞內(nèi)遞送并協(xié)同AK-137載體自身抗炎性能，在急性肺損傷和急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型中展現(xiàn)出良好的治療效果。該研究為非陽離子型聚合物基的細胞質(zhì)蛋白質(zhì)遞送載體的合理設計提供了重要的思路，因而可能擴展蛋白質(zhì)藥物的廣泛生物醫(yī)學應用。


  以上研究成果以“Bioactive Phosphorus Dendrimers as a Universal Protein Delivery System for Enhanced Anti-inflammation Therapy”為題，在線發(fā)表于國際著名期刊ACS Nano (DOI: 10.1021/acsnano.3c09589)。東華大學生物與醫(yī)學工程學院沈明武研究員、史向陽教授與法國國家科學研究中心Jean-Pierre Majoral教授為共同通訊作者，東華大學博士生孫虎嘯為第一作者。該工作得到了國家重點研發(fā)計劃、上海市科委政府間國際科技合作項目、上海市科委外專項目等項目的資助。


  文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acsnano.3c09589

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