華南理工曹曉東教授、高會(huì)場(chǎng)副教授團(tuán)隊(duì) AFM：工程化雙重電活性人工神經(jīng)導(dǎo)管通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境介導(dǎo)周?chē)窠?jīng)再生
周?chē)窠?jīng)在人體分布廣泛，疾病和意外事故造成的組織損傷往往伴隨局部周?chē)窠?jīng)的缺失或損壞。由于周?chē)窠?jīng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難依靠基體實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)，導(dǎo)致缺損神經(jīng)所控制的感覺(jué)和所支配的運(yùn)動(dòng)受到影響，顯著影響患者生活質(zhì)量。目前對(duì)于長(zhǎng)距離周?chē)窠?jīng)缺損的臨床治療方法主要采用自體神經(jīng)移植。自體移植是臨床的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但由于受到供體來(lái)源和修復(fù)距離的限制，無(wú)法完全滿(mǎn)足臨床需求。近年來(lái)人工神經(jīng)導(dǎo)管已成為治療長(zhǎng)距離周?chē)窠?jīng)缺損的重要方法，現(xiàn)有神經(jīng)導(dǎo)管產(chǎn)品因存在缺乏生物活性、無(wú)法傳遞電生理信號(hào)等問(wèn)題，對(duì)長(zhǎng)距離周?chē)窠?jīng)缺損修復(fù)效果欠佳，難以達(dá)到自體移植的修復(fù)效果，更多地作為自體移植后的神經(jīng)保護(hù)裝置使用。目前研究以及臨床實(shí)踐表明，采用電活性材料構(gòu)建人工神經(jīng)導(dǎo)管，賦予人工神經(jīng)導(dǎo)管導(dǎo)電或自發(fā)電的電活性，構(gòu)建有利于周?chē)窠?jīng)再生的電生理微環(huán)境，是提高人工神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)效果的有效策略。但目前仍然缺乏具有導(dǎo)電性和自發(fā)電性一體的人工神經(jīng)導(dǎo)管，并且電活性材料在周?chē)窠?jīng)修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用還面臨著起效機(jī)制不明確，應(yīng)用形式受限，無(wú)法滿(mǎn)足臨床實(shí)際手術(shù)需求等挑戰(zhàn)。此外，電活性材料對(duì)免疫微環(huán)境的調(diào)控規(guī)律及其促周?chē)窠?jīng)再生的分子機(jī)制尚不清楚。這都極大地限制了電活性人工神經(jīng)導(dǎo)管在治療周?chē)窠?jīng)缺損中的應(yīng)用。
針對(duì)以上問(wèn)題，華南理工大學(xué)曹曉東教授與高會(huì)場(chǎng)副教授報(bào)道了一種具有導(dǎo)電與壓電雙重電活性的PVDF/PLCL/PEDOT人工神經(jīng)導(dǎo)管，該導(dǎo)管具有良好的自發(fā)電性能，可以通過(guò)促進(jìn)雪旺細(xì)胞的成熟、成髓鞘以及分泌活性因子來(lái)促進(jìn)缺損周?chē)窠?jīng)的再生。該工作從分子細(xì)胞學(xué)的角度闡明了電活性材料調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境促進(jìn)周?chē)窠?jīng)修復(fù)再生的可能分子機(jī)制：通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞的鈣離子通道蛋白從而激活PI3K/AKT-Nrf2 抗炎信號(hào)通路，最終促進(jìn)巨噬細(xì)胞的募集、M2 極化以及抗炎蛋白分泌，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的旁分泌系統(tǒng)募集雪旺細(xì)胞并促進(jìn)其成熟，進(jìn)而間接促進(jìn)周?chē)窠?jīng)修復(fù)。該工作以“Engineered PVDF/PLCL/PEDOT Dual Electroactive Nerve Conduit to Mediate Peripheral Nerve Regeneration by Modulating the Immune Microenvironment”為題發(fā)表在國(guó)際權(quán)威期刊Advanced Functional Materials上（Adv. Funct. Mater. 2024, 2400217），曹曉東教授和高會(huì)場(chǎng)副教授為該文的通訊作者，華南理工大學(xué)2021級(jí)碩士研究生王琪琪為文章第一作者。
圖1 PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性人工神經(jīng)導(dǎo)管通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境間接促進(jìn)周?chē)窠?jīng)修復(fù)示意圖。
圖2. PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性復(fù)合薄膜的制備與性能表征
以PVDF、PLCL、PEDOT為材料，通過(guò)退火結(jié)晶以及相分離的制備工藝（圖2A）制備了PEDOT納米粒子分散均勻且具有微孔結(jié)構(gòu)的PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合薄膜（圖2B）。該復(fù)合薄膜具有良好的力學(xué)性能（圖2C），最大拉伸應(yīng)力可達(dá)15.4MPa，可伸長(zhǎng)至681%以上（圖2D），能夠滿(mǎn)足在實(shí)際應(yīng)用中耐縫合以及抗扭結(jié)的力學(xué)需求。復(fù)合膜的電導(dǎo)率達(dá)到6.99×10-7S/cm，可促進(jìn)雪旺細(xì)胞髓鞘化（圖2E），同時(shí)退火結(jié)晶的工藝保留了PVDF的β壓電結(jié)晶相（圖2F-G），保證了其復(fù)合膜具有壓電性能。
圖3 PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性材料的電學(xué)性能及其生物相容性
為了評(píng)估材料良好的導(dǎo)電性是否可以在體內(nèi)傳遞電信號(hào)，將復(fù)合膜卷曲成管狀，植入大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型中，然后收集復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（CMAP），發(fā)現(xiàn)電活性神經(jīng)導(dǎo)管可以在一定程度上傳遞神經(jīng)電信號(hào)，可植入初期作為“人工神經(jīng)”替代缺損神經(jīng)傳遞電信號(hào)（圖3B）。同時(shí)，當(dāng)對(duì)PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合膜施加不同大小的機(jī)械力（0.5 N、2 N、4 N），復(fù)合膜發(fā)出不同電壓水平（1.44 V、1.84 V、3.2 V）（圖3D），表明電活性復(fù)合膜可以將機(jī)械能轉(zhuǎn)化為電能，當(dāng)其在體內(nèi)接受到肌肉的擠壓時(shí)可以自發(fā)電刺激，從而刺激受損神經(jīng)再生。此外，PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合膜也具有良好的生物活性（圖3E-F）。
圖4. PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性材料促進(jìn)周?chē)窠?jīng)修復(fù)的有效性驗(yàn)證
首先通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合膜對(duì)周?chē)窠?jīng)修復(fù)的有效性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合膜可顯著上調(diào)表達(dá)SOX-10、BDNF 和NGF，并下調(diào)表達(dá)的NCAM基因（圖4F），這表明雙重電活性復(fù)合膜能有效促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖，成熟、成髓鞘。進(jìn)一步將其卷曲成管，植入大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型中，評(píng)價(jià)其坐骨神經(jīng)修復(fù)效果。結(jié)果表明，電活性神經(jīng)導(dǎo)管可以顯著促進(jìn)髓鞘形成和軸突伸長(zhǎng)，并促進(jìn)再生神經(jīng)中新生血管成熟，修復(fù)效果與自體移植組相近（圖4A-E）。
圖5.PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性神經(jīng)導(dǎo)管促進(jìn)缺損坐骨神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)功能恢復(fù)及其支配的運(yùn)動(dòng)功能重建
本研究進(jìn)一步通過(guò)Masson染色、SFI運(yùn)動(dòng)功能指數(shù)以及CMAP肌肉動(dòng)作電位測(cè)定評(píng)估PVDF/PLCL/PEDOT電活性神經(jīng)導(dǎo)管促進(jìn)缺損坐骨神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)功能恢復(fù)及其支配的運(yùn)動(dòng)功能重建的效果。結(jié)果顯示，導(dǎo)管組可以抑制受損神經(jīng)所支配腓腸肌的萎縮，減少膠原沉積（圖5 A-B），所有實(shí)驗(yàn)組在第1周時(shí)都已與空白對(duì)照組的SFI指數(shù)出現(xiàn)顯著差異，并且隨著時(shí)間的推移，顯著差異越來(lái)越大（圖5C）。CMAP的結(jié)果表明，導(dǎo)管組傳導(dǎo)電信號(hào)的功能與自體移植組相似（圖5D-F）。這些結(jié)果表明，電活性神經(jīng)導(dǎo)管在促進(jìn)受損周?chē)窠?jīng)再生方面具有優(yōu)越的功效，其修復(fù)效果甚至可以與自體神經(jīng)移植物相媲美。值得一提的是，導(dǎo)管+超聲組在各個(gè)維度上修復(fù)效果都次于導(dǎo)管組，這是由于超聲形成的熱效應(yīng)和空化效應(yīng)對(duì)組織修復(fù)產(chǎn)生不利影響。
圖6. 雙重電活性材料通過(guò)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞行為影響雪旺細(xì)胞
眾所周知，當(dāng)組織損傷發(fā)生時(shí)，免疫系統(tǒng)的反應(yīng)對(duì)組織修復(fù)至關(guān)重要。本研究通過(guò)巨噬細(xì)胞與雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探究了在電活性材料的介導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞對(duì)雪旺細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，電活性復(fù)合薄膜可以通過(guò)影響巨噬細(xì)胞的旁分泌系統(tǒng)對(duì)雪旺細(xì)胞產(chǎn)生良好的募集效果（圖6A），并且可以顯著促進(jìn)雪旺細(xì)胞成熟、成髓鞘和分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（圖6B-C）。進(jìn)一步探索雙重電活性復(fù)合薄膜對(duì)巨噬細(xì)胞的具體作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電活性材料具有募集巨噬細(xì)胞的能力，并且導(dǎo)電和壓電性具有協(xié)同促進(jìn)巨噬細(xì)胞募集的效果（圖6D）。此外，其還有效地上調(diào)了抗炎因子（ARG-1、CD163）的表達(dá)，而下調(diào)了促炎因子（TNF-α，IL-1β）的表達(dá)（圖6E）。然而PLCL/PEDOT導(dǎo)電薄膜與PVDF/PLCL壓電薄膜并沒(méi)有顯示同樣的效果，說(shuō)明導(dǎo)電性和壓電性在發(fā)揮抗炎效果的層面具有顯著的協(xié)同作用。這些結(jié)果表明雙重電活性材料具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向 M2 抗炎表型的轉(zhuǎn)變的能力（圖6F）。
圖7. 雙重電活性復(fù)合薄膜激活了PI3K/AKT-Nrf2信號(hào)通路達(dá)到抗炎效果。
為了進(jìn)一步確定電活性材料具有抗炎作用的分子機(jī)制，本研究通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，WB實(shí)驗(yàn)以及免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)對(duì)可能的信號(hào)機(jī)制進(jìn)行篩選 (圖7)。研究發(fā)現(xiàn)，電活性材料可以上調(diào)PI3K，AKT以及Nrf-2的基因表達(dá)，并上調(diào)p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平。并通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)PVDF/PLCL/PEDOT組中核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2發(fā)生了核轉(zhuǎn)移。初步判定PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性復(fù)合膜具有通過(guò)促進(jìn)PI3K和AKT的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)Nrf-2的核轉(zhuǎn)移來(lái)達(dá)到調(diào)控炎癥環(huán)境，上調(diào)抗炎蛋白表達(dá)而抑制促炎蛋白表達(dá)的效果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一論點(diǎn)，在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加PI3K抑制劑LY294002，抑制PI3/AKT信號(hào)通路的激活，發(fā)現(xiàn)添加抑制劑后所有組別的PI3K均無(wú)上調(diào)，且其下游抗炎蛋白CD163和ARG-1的也未被上調(diào)，因此反向驗(yàn)證了電活性復(fù)合膜確是通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境。
圖8. 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性導(dǎo)管通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境
為了進(jìn)一步確認(rèn)電活性材料在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中仍然具有同樣的抗炎效果，本研究將PVDF/PLCL/PEDOT復(fù)合膜卷曲成神經(jīng)導(dǎo)管移入到大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型中，分別在第1周和第4周將在受損神經(jīng)組織的遠(yuǎn)端、近端以及再生部分解剖離體，采用RT-qPCR檢測(cè)信號(hào)通路中關(guān)鍵基因（PI3K、AKT、HO-1）的表達(dá)。同時(shí)，對(duì)M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD86以及M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD206進(jìn)行免疫熒光染色，表征在電活性神經(jīng)導(dǎo)管介導(dǎo)下?lián)p傷部位的炎癥環(huán)境。結(jié)果表明，在電活性神經(jīng)導(dǎo)管的介導(dǎo)下，PI3K、AKT和HO-1均顯著上調(diào)（圖8A），且CD206與CD86的免疫熒光染色結(jié)果與RT-qPCR的結(jié)果保持一致，表明電活性神經(jīng)導(dǎo)管在體內(nèi)仍然具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2抗炎表型極化的效果（圖8C）。同時(shí)，為了反向驗(yàn)證信號(hào)通路的準(zhǔn)確性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了LY294002+導(dǎo)管組，對(duì)該組別的大鼠進(jìn)行隔日腹腔注射PI3K抑制劑LY294002的處理，持續(xù)一月。發(fā)現(xiàn)該組別顯示出了較為顯著的炎癥反應(yīng)，與純導(dǎo)管組的結(jié)果相反，進(jìn)一步確定了雙重電活性神經(jīng)導(dǎo)管是通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路達(dá)到的抗炎效果（圖8B）。
圖9. 雙重電活性神經(jīng)導(dǎo)管通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境間接促進(jìn)周?chē)窠?jīng)修復(fù)
體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了在電活性材介導(dǎo)下巨噬細(xì)胞會(huì)分泌相關(guān)活性因子，從而影響雪旺細(xì)胞，間接促進(jìn)周?chē)窠?jīng)修復(fù)，本研究在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步論證了這一論點(diǎn)。采用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與神經(jīng)修復(fù)相關(guān)蛋白（NGF、BDNF、NCAM）的表達(dá)，結(jié)果表明其表達(dá)與抗炎相關(guān)蛋白的表達(dá)趨勢(shì)相同，并且在具有PI3K抑制劑LY294002的組別中，NGF、BDNF的表達(dá)顯著下降且NCAM升高（圖9A）。為了更加直觀和全面的分析本研究中所有RT-qPCR基因檢測(cè)結(jié)果，將所有組別在兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)（第1周，第4周）上涉及到的所有基因表達(dá)水平進(jìn)行了聚類(lèi)熱圖分析（圖9B）。導(dǎo)管組組不管是在哪個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，都能激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)HO-1的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境，并上調(diào)抗炎因子的表達(dá)而抑制促炎因子的表達(dá)，最終促進(jìn)周?chē)窠?jīng)修復(fù)。
圖10. 電活性材料對(duì)免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)對(duì)受損坐骨神經(jīng)的修復(fù)具有重要意義
為了驗(yàn)證炎癥信號(hào)通路的阻斷是否最終會(huì)影響其運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，本工作還設(shè)置了導(dǎo)管+LY294002組。結(jié)果顯示，不同組對(duì)腓腸肌萎縮的抑制程度如下：空白組<導(dǎo)管+LY294002組<導(dǎo)管組（圖10A-B），表明雖然電活性神經(jīng)導(dǎo)管可顯著抑制腓腸肌萎縮，但當(dāng)炎癥信號(hào)通路被阻斷時(shí)，電活性神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)腓腸肌的抑制作用大大減弱。此外，還對(duì)再生神經(jīng)的縱切面進(jìn)行了H&E染色（圖10C），發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管組在第28天實(shí)現(xiàn)了橫斷神經(jīng)的完全連接，而導(dǎo)管+LY294002組尚未實(shí)現(xiàn)損傷神經(jīng)的遠(yuǎn)端與近端連接。SFI運(yùn)動(dòng)功能指數(shù)的測(cè)試結(jié)果（圖10D），甲苯胺藍(lán)染色（圖10E）和透射電鏡觀察再生神經(jīng)的軸突形成和髓鞘再生結(jié)果（圖10F）以及CD31免疫組化染色結(jié)果（圖10G）都顯示導(dǎo)管組具有較好的促坐骨神經(jīng)再生的作用。然而，當(dāng)PI3K/AKT-Nrf2信號(hào)通路被阻斷時(shí)，其修復(fù)效果大打折扣，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種現(xiàn)象變得更加突出。從上述結(jié)果不難得出，免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)對(duì)周?chē)窠?jīng)的修復(fù)至關(guān)重要，當(dāng)免疫微環(huán)境調(diào)控途徑被阻斷時(shí)，其促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的作用大大減弱。
本研究證明了電活性材料在調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境和周?chē)窠?jīng)修復(fù)中的有效性，同時(shí)突出了免疫調(diào)節(jié)在周?chē)窠?jīng)修復(fù)中的關(guān)鍵作用，為電活性人工神經(jīng)導(dǎo)管應(yīng)用于臨床周?chē)窠?jīng)修復(fù)提供了理論依據(jù)。
該研究工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金（31971261、52272276、52073103）、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金（2023A1515012232、2020A1515010668）等經(jīng)費(fèi)資助。
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202400217
