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天津工業(yè)大學高輝教授團隊 Nano Today：利用GalNAc衍生的納米平臺阻斷Fn-宿主細胞相互作用以增強結直腸癌的化療效果
2024-05-08  來源：高分子科技

  結直腸癌（CRC）是發(fā)生在結直腸部位的消化道惡性腫瘤，其全球死亡率在惡性腫瘤中高居第二位。對于CRC中晚期患者來說化療仍是主要治療策略。然而，化療耐藥性導致的復發(fā)和轉移，使得化療的療效面臨嚴峻挑戰(zhàn)。越來越多的證據表明：CRC化療后的復發(fā)與一種特定的腸道微生物-具核梭桿菌（Fn）密切相關。Fn能夠通過其表面的凝集素Fap2與CRC細胞表面過度表達的Gal-GalNAc特異性結合黏附到CRC細胞，而CRC部位Fn的異常增殖會促進腫瘤的發(fā)展和轉移，誘導CRC細胞產生化療耐藥性。因此針對Fn進行靶向干預，減少其在腫瘤組織內的定植，有望顯著增強化療的治療效果，并降低癌癥復發(fā)的風險。


  為此，天津工業(yè)大學高輝教授團隊提出了一種特異性抗Fn黏附策略，通過構建GalNAc衍生納米平臺（OGPA/P-C）來改善CRC的化療。這種CRC微環(huán)境適應性納米平臺可在腫瘤內靶向遞送抗癌藥物奧沙利鉑（OxPt），同時阻斷Fn與宿主細胞的相互作用，從而逆轉Fn引起的耐藥性，提高化療效果（圖1）。研究團隊首先將OxPt和偶氮苯（AZO）偶聯(lián)到GalNAc修飾的寡聚聚乙烯亞胺（OEI）上，再通過聚乙二醇-β-環(huán)糊精（PEG-CD）和偶氮苯基團的主客體相互作用組裝得到最終的納米平臺OGPA/P-C。其中PEG組分在納米表面形成的“隱形”保護層，不僅可以屏蔽GalNAc介導的肝臟靶向作用、還可以延長納米藥物的循環(huán)時間并增強其在腫瘤組織的蓄積；而在CRC相關偶氮還原酶觸發(fā)下納米平臺解組裝使得GalNAc暴露并通過Fap2依賴性競爭機制阻止Fn黏附于CRC上，逆轉Fn誘導的化療耐藥性；局部釋放化療藥物OxPt，有效增強抗腫瘤效果。 


圖1. GalNAc衍生的抗黏附納米平臺通過阻斷Fn-宿主相互作用以增強CRC化療的示意圖。（a）OGPA的制備及其與PEG-CD通過超分子自組裝得到OGPA/P-C。（b）OGPA/P-C對Fn感染的CRC的治療機制：i）屏蔽GalNAc介導的肝臟靶向作用、延長納米藥物的血液循環(huán)時間并增強其在腫瘤組織的蓄積；ii）在CRC相關偶氮還原酶觸發(fā)下暴露GalNAc靶向Fn，干擾Fap2-Gal-GalNAc相互作用，從而阻斷Fn與CRC細胞的黏附，逆轉Fn誘導的化療耐藥性。iii）局部釋放化療藥物OxPt，有效消融CRC腫瘤。


  研究團隊首先測定了OGPA/P-C的納米粒徑，血液穩(wěn)定性以及其在腫瘤微環(huán)境中的響應性釋放藥物能力。如圖2c-d所示OGPA/P-C納米平臺的平均流體力學直徑為169.7 nm，SEM觀察到其形態(tài)為均勻的球形。此外，為了證明該納米粒子的穩(wěn)定性，測定了其與含有10%血清的PBS共同培養(yǎng)孵育后的粒徑變化。結果顯示在長達100小時內OGPA/P-C納米平臺的粒徑大小和PDI沒有顯著變化，表明該納米平臺在血液中具有極佳的穩(wěn)定性（圖2e）。此外，還利用Na2S2O4作為CRC相關偶氮還原酶的模擬物來確定納米平臺的刺激響應行為。如圖2c所示，經Na2S2O4處理后，由于OGPA和P-C之間的結構被破壞OGPA/P-C平均流體力學直徑從169.7 nm增至385.2 nm。紫外可見光譜也進一步證明了該結構的變化（圖2f）。通過ICP-MS對藥物釋放行為進行了測定，結果顯示OGPA/P-C納米平臺可在模擬CRC微環(huán)境中發(fā)生解離，從而觸發(fā)藥物的按需釋放（圖2g）。 


圖2. GalNAc衍生的抗黏附納米平臺的合成與表征。（a）OGPA/P-C的制備示意圖。（b）OGPA和OGPA/P-C的紫外可見光譜。（c）通過DLS測定在有/無Na2S2O4情況下OGPA/P-C納米平臺的水合粒徑分布。（d）OGPA/P-C的SEM圖像。（e）OGPA/P-C納米平臺在10%血清溶液中培養(yǎng)后的水合粒徑和PDI。（f）Na2S2O4存在（藍線）和不存在（紅線）時OGPA/P-C納米平臺的紫外可見光譜。（g）在有/無Na2S2O4情況下，Pt從OGPA/P-C納米平臺中的累積釋放曲線。


  研究人員隨后探究了OGPA/P-C與Fn的靶向結合機制（圖3a）。如圖3b所示，在與負載ICG的OGPA/P-C（ICG@OGPA/P-C）共培養(yǎng)后，細菌周圍沒有熒光產生，表明ICG@OGPA/P-C與Fn沒有結合。但在加入偶氮還原酶后可以觀察到明顯的紅色熒光，且熒光強度與OGPA組相當，該結果表明，在偶氮還原酶作用下PEG脫屏蔽，暴露的GalNAc會與Fn產生強大的結合效應。此外，當Fn與游離的GalNAc孵育后再用負載ICG的OGPA（ICG@OGPA）處理時，細菌的紅色熒光會大幅減少，這表明OGPA與Fn的結合是由Fap2-GalNAc相互作用介導的。 


圖3. OGPA/P-C與Fn的靶向結合。（a）OGPA/P-C與Fn的結合機制。（b）CLSM觀察不同組分處理后的Fn
接下來研究人員在體外測定了OPGA/P-C對Fn黏附腫瘤細胞的抑制作用（圖4a）。結果表明，CT26和HCT116兩種細胞都有較高的Gal-GalNAc表達水平，并且GalNAc和GalNAc衍生的納米平臺都具有抑制Fn在CT26和HCT116細胞表面定植的能力（圖4b-i）。 


圖4. 體外抑制Fn黏附CRC細胞。（a）OGPA/P-C阻斷Fn黏附CRC細胞示意圖。（b）CLSM圖像顯示FITC標記的Fn與CT26和（c）HCT116細胞的黏附情況。（d-e）FITC熒光定量分析。（f）CLSM圖像顯示CT26和（g）HCT116細胞經不同樣品處理后Fn的黏附情況。(h-i）FITC熒光定量分析。


  為了進一步驗證GalNAc是否可以通過抑制Fn對CRC細胞的黏附從而逆轉CRC細胞的化療耐藥性，在Fn感染的細胞模型中評估了納米平臺的抗腫瘤活性。結果顯示OxPt對Fn感染細胞的細胞毒性顯著降低，即Fn可誘導HCT116和CT26細胞對OxPt產生化學耐藥性。然而，在加入游離的GalNAc以后，CT26/Fn和HCT16/Fn組細胞的存活率均有所下降，并且隨著GalNAc濃度的不斷增加，細胞的存活率呈現出比較明顯的下降趨勢，該結果表明GalNAc可以克服Fn誘導的CRC耐藥性（圖5a-b）。隨后進一步研究了OGPA/P-C對Fn感染的CRC細胞的作用。如圖5c-d所示，用含有GalNAc的OGP和OGPA/P-C處理Fn感染的CT26和HCT116細胞后，其細胞活力低于不含GalNAc的OP和OPA/P-C，該結果表明GalNAc衍生的納米平臺可通過阻斷Fn-宿主細胞間的相互作用有效逆轉CRC細胞的耐藥性。研究表明，Fn通過激活自噬途徑誘導CRC的化療耐藥性，進一步損害化療效果。因此研究人員使用AO染色法和蛋白印跡法評估了Fn感染的CT26細胞在不同組分處理后的自噬活性。結果表明Fn會誘導CT26細胞發(fā)生自噬，而用OGPA/P-C處理Fn感染的CT26細胞后，其自噬活性顯著降低（圖5e-f）。即OGPA/P-C通過阻斷Fn對CRC細胞的黏附可有效抑制Fn誘導的自噬激活進而克服化療耐藥性（圖5g）。


  隨后在BALB/c雄性小鼠腫瘤模型中，利用尾靜脈注射ICG標記的OGPA、OGPA/P-C和游離ICG來評估藥物在體內的生物分布以及在腫瘤部位的積累。結果如圖5h-j所示，在整個檢測期間OGPA/P-C組在腫瘤中的富集程度最高。在注射后24小時，由于GalNAc具有很強的肝臟靶向能力，OGPA大量積聚在肝臟中，而OGPA/P-C則積聚在腫瘤部位，這些結果表明，PEG的引入很好的屏蔽了GalNAc的肝臟靶向性。 


圖5. 體外抗腫瘤活性和體內生物分布評估。（a）OxPt和GalNAc對CT26和Fn感染的CT26細胞的細胞毒性。（b）OxPt和GalNAc對HCT116和Fn感染的HCT116細胞的細胞毒性。（c）含有不同Pt濃度的樣品對CT26和Fn感染的CT26細胞的細胞毒性。（d）不同Pt濃度（0-100 μM）的樣品對HCT116和Fn感染的HCT116細胞的細胞毒性。（e）經PBS、OPA/P-C和OGPA/P-C處理后，Fn感染CT26細胞的AO染色圖像。（f）相應的紅綠比定量分析。（g）OGPA/P-C通過阻斷Fn-宿主相互作用和抑制自噬激活來恢復OxPt活性示意圖。（h）ICG、ICG@OGPA和ICG@OGPA/P-C經尾靜脈注射到攜帶CT26腫瘤的BALB/c小鼠體內后0.5、1、3、6、9和24小時的生物分布（n = 3）。（i）體內成像和（j）給藥后24小時離體器官和腫瘤中ICG的熒光定量分析。


  最后研究團隊探究了OGPA/P-C在體內的抗腫瘤效果。通過對小鼠腫瘤體積，小鼠體重、存活率以及主要器官的檢測，發(fā)現相比于傳統(tǒng)抗腫瘤藥物OxPt，OGPA/P-C具有更優(yōu)越的體內抗腫瘤效果和更顯著的生物安全性，并且結合免疫組化實驗結果進一步說明OGPA/P-C可通過阻斷Fn與CRC細胞的黏附，從而抑制自噬激活，克服Fn誘導的化療耐藥性（圖6a-g）。 


圖6. 抗黏附和體內抗腫瘤性能。（a）小鼠接種腫瘤細胞和治療示意圖。（b）不同治療后小鼠腫瘤生長曲線（n = 6）。（c）治療15天后切除腫瘤的代表性照片。（d）不同樣品治療后小鼠在40天內的存活率。其中（+）和（-）指靜脈注射Fn與否。（e）具有代表性的腫瘤切片免疫組化染色。（f）不同樣品治療后小鼠體重的變化。（g）小鼠在不同樣品治療后主要器官和腫瘤的代表性H&E染色圖像。


  總之，該研究團隊成功開發(fā)了一種非致死性策略，通過利用GalNAc衍生的抗黏附納米平臺（OGPA/P-C）特異性阻斷Fn-宿主細胞相互作用來逆轉Fn誘導的化療耐藥性，從而增強Fn相關CRC的化療效果。該團隊提出的非致死性抗黏附策略為提高Fn感染的CRC和其他實體瘤的化療效果提供了一種創(chuàng)新思路。


  以上研究成果以“Blocking Fusobacterium nucleatum-host cell interactions with responsive supramolecular GalNAc-derived nanoplatform for enhanced chemotherapy in colorectal cancer”為題，發(fā)表于期刊Nano Today（2024, 24, 102288. DOI: 10.1016/j.nantod.2024.102288）。天津工業(yè)大學高輝教授和余云健講師為通訊作者，天津工業(yè)大學武騰玲講師和天津理工大學碩士研究生靳丹陽為共同第一作者。這項工作得到了國家自然科學基金、天津市自然科學基金重點項目、天津市特聘教授以及天津市透明質酸應用研究企業(yè)重點實驗室開放基金的支持。


  文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102288

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（責任編輯：xu）
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