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康復(fù)大學(xué)周祺惠團(tuán)隊(duì)/青大附院王志國 AFM：生物活性角蛋白水凝膠微針貼片用于病理性瘢痕治療
2024-10-03  來源：高分子科技

  病理性瘢痕（Pathological scars，PS）是傷口異常愈合導(dǎo)致皮膚過度纖維化的結(jié)果，包括增生性瘢痕（Hypertrophic scars）和瘢痕疙瘩（keloids），發(fā)病原因與炎癥反應(yīng)和肌成纖維細(xì)胞的過度激活密切相關(guān)。它不僅凸出皮膚表面過度增生，而且會(huì)導(dǎo)致皮膚與關(guān)節(jié)功能障礙、瘙癢或有刺痛灼熱感，逐漸發(fā)展長(zhǎng)大后會(huì)形成大面積瘢痕腫塊，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。目前，治療瘢痕疙瘩的方式包括手術(shù)切除、放療、光電、局部注射糖皮質(zhì)激素和硅酮凝膠貼等。這些治療方法具有相關(guān)缺陷，如手術(shù)或放療后的高復(fù)發(fā)率（20%~90%）和導(dǎo)致正常組織損傷、減張/加壓/保濕治療所需時(shí)間過久，且無法根治。其中，經(jīng)皮注射相關(guān)藥物治療被認(rèn)為是最方便、最有效的策略之一，因?yàn)樗軌虼┩钢旅艿鸟：劢M織，使藥物直接作用于病變部位。但局部注射引起的劇烈疼痛讓患者難以接受，且具有藥物吸收快、不均勻分布和需要專業(yè)醫(yī)務(wù)人員操作缺點(diǎn)。因此，制定一種自我管理策略，實(shí)現(xiàn)均勻、緩慢地、微創(chuàng)的經(jīng)皮注射給藥，對(duì)PS的有效治療至關(guān)重要。


  基于以上，來自康復(fù)大學(xué)周祺惠研究員團(tuán)隊(duì)與青島大學(xué)附屬醫(yī)院王志國主任合作，開發(fā)了一種基于脂肪來源干細(xì)胞濃縮條件培養(yǎng)基（ADSCC-CM）交聯(lián)角蛋白水凝膠的新型微針（MN）貼片，用于負(fù)載曲安奈德（TA），通過ADSCC-CM和TA的雙藥物遞送，發(fā)揮減輕炎癥和調(diào)控肌成纖維細(xì)胞行為的協(xié)同作用，同時(shí)達(dá)到避免現(xiàn)有治療技術(shù)缺點(diǎn)的目的。該研究以題為“ADSCC-CM-Induced Keratin Hydrogel-Based Bioactive Microneedle Patch Containing Triamcinolone Acetonide for the Treatment of Pathological Scar”發(fā)表在《Advanced Functional Materials》期刊上。青島大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形外科碩士研究生李聰和康復(fù)大學(xué)易兵成副研究員為本論文共同第一作者。


  本研究首次發(fā)現(xiàn)ADSCC-CM可與角蛋白相互交聯(lián)形成水凝膠，通過攜載臨床PS治療常用藥物TA，創(chuàng)新性地使用該水凝膠制作成微針貼片（TA@AC-MN），以微創(chuàng)的方式實(shí)現(xiàn)ADSCC-CM和TA雙藥物釋放。TA@AC-MN的制備工藝包括提取人發(fā)來源角蛋白、制備ADSCC-CM和提高TA溶液的分散穩(wěn)定性。TA@AC-MN治療PS的機(jī)制是通過TA和ADSCC-CM對(duì)肌成纖維細(xì)胞表型和組織炎癥抑制的協(xié)同作用（圖1）。


圖1. TA@AC-MN的制備和治療PS的示意圖。


  具體到AC-MN的制備過程，使用化學(xué)還原法提取人發(fā)角蛋白，將獲取的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基通過冷凍干燥機(jī)制備ADSCC-CM。在真空條件下，將PBS溶液沉淀到PDMS模具中去除空氣。隨后，將含角蛋白和ADSCC-CM的PBS溶液使用超聲震蕩融進(jìn)于每個(gè)針腔中，并使溶液均勻分散。去除多余的溶液，在空氣中靜置形成水凝膠后，將透明質(zhì)酸鈉(HA)溶液加載到模具上，待完全干燥，即獲得AC-MN微針貼片。通過電鏡掃描、承重實(shí)驗(yàn)、透皮實(shí)驗(yàn)等證明ADSCC-CM與角蛋白交聯(lián)形成的水凝膠所制備的微針具有良好的形態(tài)和機(jī)械性能，足以保證刺破皮膚達(dá)到藥物遞送的目的（圖2）。


圖2. AC-MN制作過程及表征。


  在對(duì)肌成纖維細(xì)胞表型調(diào)控方面，作者選用人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（HSFs）作為細(xì)胞模型驗(yàn)證效果。通過細(xì)胞活力CCK-8分析，可以發(fā)現(xiàn)ADSCC-CM和TA在抑制HSFs活力方面具有協(xié)同作用。在脂多糖（LPS）的炎癥環(huán)境刺激下，通過DCFH探針技術(shù)監(jiān)測(cè)活性氧(ROS)含量，觀察到ADSCC-CM和TA可以明顯減少炎癥刺激下HSFs的ROS產(chǎn)生；同時(shí)，在PCR實(shí)驗(yàn)中研究證實(shí)ADSCC-CM和TA可以明顯抑制HSFs與瘢痕形成相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄（圖3）。


圖3. 體外評(píng)價(jià)ADSCC-CM和TA對(duì)抑制HSFs過度活化和炎癥反應(yīng)的協(xié)同作用。


  在構(gòu)建的兔耳瘢痕模型中，TA@AC-MN對(duì)瘢痕起到良好的治療效果。TA@AC-MN治療之后的瘢痕外觀更加接近正常皮膚。通過超聲波測(cè)量計(jì)算瘢痕指數(shù)（SEI），TA@AC-MN治療效果與TA注射的方式效果相近，分別為1.36和1.31。并且生物力學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TA@AC-MN可明顯提高瘢痕修復(fù)后的最大抗?fàn)坷Γ▓D4）。


圖4. TA@AC-MN對(duì)兔耳瘢痕模型治療的體內(nèi)評(píng)價(jià)


  對(duì)于所設(shè)計(jì)微針的體內(nèi)抗炎作用分析，一方面，透光實(shí)驗(yàn)反映出TA@AC-MN可以明顯減少因炎癥反應(yīng)導(dǎo)致紅腫的面積；另一方面，通過免疫組織化學(xué)分析，進(jìn)一步證實(shí)TA@AC-MN可抑制與PS形成相關(guān)的促炎癥因子的表達(dá)，并促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)（圖5）。


圖5. TA@AC-MN對(duì)兔耳瘢痕炎癥的抑制作用評(píng)價(jià)


  為更好地評(píng)價(jià)TA@AC-MN對(duì)PS的治療效果。該研究進(jìn)行了H&E染色、Masson染色、Sirius染色，以對(duì)瘢痕修復(fù)后的微觀層面評(píng)估。H&E染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)TA@ACMN治療后，瘢痕的表皮和真皮組織厚度明顯減少，接近正常皮膚厚度，并伴有成纖維細(xì)胞密度降低和膠原排列規(guī)律增加。在評(píng)估瘢痕修復(fù)后膠原變化方面，Masson染色結(jié)果顯示紅色的肌纖維大量減少，呈現(xiàn)以藍(lán)色膠原纖維為主的瘢痕修復(fù)，表明MN貼片可以有效抑制肌成纖維細(xì)胞的活化；而在瘢痕修復(fù)后期，TA@AC-MN可以促進(jìn)膠原重塑，使膠原排列更加接近于正常皮膚的膠原排列。Sirius染色的結(jié)果證實(shí)TA@AC-MN治療可以促進(jìn)I型膠原和III型膠原比例趨于正常，實(shí)現(xiàn)趨向于健康皮膚修復(fù)的目的，避免瘢痕形成（圖6）。


圖6. TA@AC-MN治療后家兔耳瘢痕組織分析


  在治療機(jī)制探討方面，作者通過免疫組織化學(xué)進(jìn)一步分析，證實(shí)TA@AC-MN可以抑制促進(jìn)PS形成的相關(guān)蛋白TGF-β、WNT、TIMP-1表達(dá)（圖7）。


圖7. 免疫組織化學(xué)分析TA@AC-MN在瘢痕治療中的作用機(jī)制。


  綜上，該研究開發(fā)了一種基于ADSCC-CM交聯(lián)角蛋白水凝膠的新型微針貼片，用于負(fù)載TA，通過ADSCC-CM和TA的雙藥物遞送達(dá)到減輕嚴(yán)重炎癥和抑制HSF的過度激活來治療PS的目的。ADSCC-CM被首次報(bào)道用作交聯(lián)劑來構(gòu)建角蛋白水凝膠，其具有優(yōu)異的力學(xué)性能，并且可以成功穿透PS組織。當(dāng)AC-MN作為藥物載體負(fù)載TA時(shí)，在TA@AC-MN中觀察到TA和ADSCC-CM的雙藥物釋放特征。重要的是，TA@AC-MN釋放的TA和ADSCC-CM在體外具有協(xié)同抑制HSF過度活化的作用。在兔耳瘢痕模型中給藥4周后，TA@AC-MN能達(dá)到有效改善瘢痕體積、彈性、色澤和緊致度的治療效果？傊，該研究驗(yàn)證設(shè)計(jì)的TA@AC-MN顯示出治療PS的能力，該技術(shù)有望發(fā)展為一種自我管理、低成本、微創(chuàng)的PS臨床治療策略。


  該項(xiàng)目受到山東省泰山青年學(xué)者資助計(jì)劃（No. tsqn202306272）、山東省自然科學(xué)基金（No. ZR2020MH183、No. ZR2022MH191）、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（No. 2023YFFO715101）、國家自然科學(xué)基金（No. 82302388）、煙臺(tái)開發(fā)區(qū)產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（No. 2021RC016）、青島市科技惠民示范工程（No. 24-1-8-smjk- 11-nsh）、青島市自然科學(xué)基金（No. 23-2-1-132-zyyd-jch）和山東省重大創(chuàng)新工程（No. 2019JZZY020219）支持。


  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202400457

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