英國爵士/四院院士/牛津大學(xué) Molly Stevens教授課題組 Nat. Commun.：非侵入性細菌感染檢測納米傳感器
金黃色葡萄球菌（包括耐甲氧西林菌株）是導(dǎo)致外科植入物相關(guān)感染的主要原因，通常形成難以清除的生物膜，增加治療難度和成本。現(xiàn)有檢測方法如細菌培養(yǎng)、PCR、ELISA等盡管敏感性和特異性較高，但需侵入性采樣，耗時長、成本高，并可能引入污染風(fēng)險。為此，亟需開發(fā)一種非侵入性、原位檢測植入物感染的診斷方法，以實現(xiàn)更早期、更高效的感染識別。
鑒于此，牛津大學(xué)四院院士Molly Stevens教授課題組報道了一種非侵入性的體內(nèi)細菌植入感染的生物檢測傳感器，該檢測系統(tǒng)利用金納米簇（AuNCs）的催化性能，將其封裝在對金黃色葡萄球菌毒素響應(yīng)的脂質(zhì)體中，通傳感器在細菌毒素作用下釋放AuNCs并生成比色信號，并在小鼠感染模型中驗證了其無創(chuàng)診斷植入物感染的有效性,該平臺具有廣泛應(yīng)用潛力和成本優(yōu)勢。
論文的第一作者為英國帝國理工博士（現(xiàn)為英國牛津大學(xué)博后）陳凱麗，通訊作者是牛津大學(xué)四院院士Molly Stevens教授、皇家墨爾本理工大學(xué)Irene Yarovsky教授、倫敦國王學(xué)院Adrian Najer助理教授，相關(guān)成果以“Non-invasive in vivo sensing of bacterial implant infection using catalytically- optimised gold nanocluster-loaded liposomes for urinary readout ”為題，發(fā)表在《Nature Communications》上。
文章要點
1)整體設(shè)計: 該傳感器基于金納米簇（AuNCs）的設(shè)計，將Au(III)還原為Au(0)后自組裝為谷胱甘肽（GSH）穩(wěn)定的AuNCs，并進一步封裝于脂質(zhì)體中形成傳感系統(tǒng)。以透明質(zhì)酸（HA）水凝膠作為植入物模型，將載有AuNCs的脂質(zhì)體嵌入凝膠中，用于測試有無細菌污染的狀態(tài)。當病原菌生長并分泌破壞脂質(zhì)膜的毒素時，脂質(zhì)體破裂，釋放AuNCs。釋放的AuNCs通過模擬腎過濾排入尿液，并在比色反應(yīng)中催化TMB底物從無色變?yōu)樗{色，從而通過尿液顏色變化指示植入物的細菌感染狀態(tài)。
圖一：金納米簇封裝的脂質(zhì)體生物傳感器的設(shè)計及其檢測細菌植入感染的機制
2)對金納米簇（AuNCs）的優(yōu)化、表征與模擬研究揭示了AuNCs的結(jié)構(gòu)與催化特性。通過透射電子顯微鏡（TEM）圖像確定了AuNCs的尺寸，其最佳合成條件為金與谷胱甘肽（GSH）1:1.5和比例，pH 10的反應(yīng)條件。催化實驗顯示，合成后AuNCs在不同pH反應(yīng)條件下催化TMB氧化的活性存在顯著差異。全原子分子動力學(xué)模擬進一步研究了AuNCs在不同鹽濃度和pH條件下的行為，包括半徑變化、核心表面對小分子（水、過氧化氫、TMB）的可及性及活性位點的動態(tài)變化。結(jié)果顯示，AuNCs的活性口袋具有動態(tài)開合特性，與水的接近程度和分布狀態(tài)密切相關(guān)，為理解其催化機制提供了分子水平的細節(jié)支持。
圖二：金納米簇的優(yōu)化、表征與模擬
3)該研究設(shè)計了AuNCs封裝的脂質(zhì)體傳感器，通過將AuNCs封裝于由腦神經(jīng)鞘磷脂（BSM）、磷脂酰膽堿（PC）、膽固醇（CH）、DSPE-PEG2k等組成的脂質(zhì)體中形成檢測系統(tǒng)。通過尺寸排阻色譜（SEC）分離未封裝的AuNCs后，發(fā)現(xiàn)pH 10條件下的AuNCs催化活性最佳，其中100倍濃縮（2 mM）條件表現(xiàn)出最優(yōu)性能。動態(tài)光散射（DLS）和Zeta電位測量表明，AuNCs封裝進脂質(zhì)體顯著改變了脂質(zhì)體的粒徑和表面電位，冷凍電鏡（Cryo-TEM）進一步驗證了AuNCs在脂質(zhì)體中的成功封裝及其穩(wěn)定性，為傳感器的高效性能提供了結(jié)構(gòu)和催化基礎(chǔ)。
圖三： 金納米簇封裝的脂質(zhì)體傳感器的組裝與表征
4)研究展示了AuNCs封裝的脂質(zhì)體對細菌毒素的體外響應(yīng)及其表征。通過將不同配方的脂質(zhì)體與細菌毒素孵育，結(jié)合TMB催化活性檢測和動態(tài)光散射（DLS）分析，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體的組分影響毒素誘導(dǎo)的AuNCs釋放效率。熒光相關(guān)光譜（FCS）表明，毒素處理導(dǎo)致脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)變化及AuNCs釋放，并通過分子亮度計算驗證了每個脂質(zhì)體中的AuNCs數(shù)量。拉曼光譜分析（SPARTA®）進一步確認毒素誘導(dǎo)的脂質(zhì)體磷脂酰膽堿水解，伴隨腦神經(jīng)鞘磷脂轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿。研究結(jié)果表明，該傳感器能夠通過檢測AuNCs釋放及膜組分變化，實現(xiàn)對細菌毒素的靈敏響應(yīng)。
圖四：由不同脂質(zhì)配方組成的金納米簇封裝脂質(zhì)體對細菌毒素的體外響應(yīng)
5)研究還展示了AuNCs封裝的脂質(zhì)體與細菌體外孵育及其表征。通過與金黃色葡萄球菌共同孵育并分離釋放的AuNCs，觀察到細菌的生長曲線與活菌計數(shù)一致。TMB氧化反應(yīng)檢測表明，細菌的存在顯著提高了AuNCs釋放的催化活性，吸光度和反應(yīng)速率均呈時間依賴性增強，直觀證實細菌分泌毒素對脂質(zhì)體的破壞效應(yīng)。此外，MTS細胞活力測試表明AuNCs和AuNCs封裝的脂質(zhì)體對RAW 264.7細胞具有良好的生物相容性，支持其作為細菌檢測傳感器的潛力。
圖五：金納米簇封裝的脂質(zhì)體與細菌的體外共培養(yǎng)及細菌生長表征
6)研究展示了基于AuNCs封裝的脂質(zhì)體傳感系統(tǒng)的比色檢測方法，用于識別細菌感染狀態(tài)。首先，在體外HA水凝膠植入物感染模型中，脂質(zhì)體傳感器在金黃色葡萄球菌污染條件下，釋放AuNCs并觸發(fā)TMB比色反應(yīng)，結(jié)果顯示反應(yīng)速率隨孵育時間（0至48小時）的延長而顯著提升。在小鼠急性植入物感染模型中，通過腹腔注射混有傳感器的HA水凝膠，與或不含金黃色葡萄球菌污染的對照組比較，感染組尿液中收集的TMB比色反應(yīng)顯示顯著增強的催化活性，進一步驗證了傳感器的高靈敏度及其在感染檢測中的潛力。
圖六：實現(xiàn)細菌感染狀態(tài)比色讀出的金納米簇脂質(zhì)體傳感系統(tǒng)
論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-53537-2
