2025年3月，中山大學楊江研究員團隊在《Journal of Controlled Release》上在線發(fā)表了題為《Inhalable pH-responsive charge-reversal polymer-small interfering RNA polyplexes for directed gene therapy of anaplastic lymphoma kinase fusion-positive lung cancer》研究性論文。該研究針對間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合陽性非小細胞肺癌（NSCLC）的治療挑戰(zhàn)，開發(fā)了一種可吸入的pH響應型電荷反轉聚合物-siRNA復合物（PPH）。傳統(tǒng)ALK酪氨酸激酶抑制劑存在耐藥性和副作用問題，而RNA干擾（RNAi）技術因siRNA遞送效率低和穩(wěn)定性差難以應用。研究團隊設計了一種由聚乙二醇（PEG）、聚β-氨基酯（PBAE）和組氨酸組成的PPH聚合物，通過靜電作用自組裝形成納米復合物。該載體在堿性胸膜液中保持負電荷以保護siRNA，在腫瘤微酸性環(huán)境中轉為正電荷，促進細胞攝取和溶酶體逃逸。PPH-siRNA復合物在體外顯著提高siRNA穩(wěn)定性，在ALK+ NSCLC細胞（H3122）中，PPH介導的siALK遞送有效抑制ALK表達，阻斷下游MAPK和PI3K-AKT信號通路，并能顯著抑制原位肺癌異種移植瘤的生長。該研究的創(chuàng)新性地將pH響應電荷反轉機制與吸入式遞送相結合，解決了siRNA肺部遞送的關鍵難題，兼具靶向性、穩(wěn)定性和生物安全性，為RNAi治療ALK+ NSCLC提供了新策略，同時也為其他呼吸系統(tǒng)疾病的核酸藥物遞送開辟了新路徑。這種非病毒載體平臺的技術突破，有望推動基因治療在臨床中的轉化應用。
研究亮點
（1）pH響應電荷反轉遞送系統(tǒng)：開發(fā)了PPH聚合物，該聚合物在堿性胸膜液中呈陰離子以保護siRNA，而在酸性腫瘤微環(huán)境中轉變?yōu)殛栯x子，增強細胞攝取和溶酶體逃逸，實現精準控釋。
（2）高效基因沉默與低毒性：通過分子動力學模擬和實驗驗證，PPH與siRNA形成穩(wěn)定復合物，體外轉染效率媲美商業(yè)PEI但毒性更低。體內實驗顯示，吸入PPH-siALK顯著抑制ALK+肺癌生長（腫瘤抑制率84.5%），并下調MAPK/PI3K-AKT信號通路。
（3）非侵入性吸入給藥策略：首次實現siRNA的吸入式遞送，藥代動力學表明藥物主要富集于肺部，減少全身暴露。呼吸功能測試證實治療改善肺通氣，且血液學與組織學評估顯示優(yōu)異生物安全性，為肺癌靶向治療提供新范式。
圖1. 通過雙正電荷的 PBAE 和 His 增強電荷反轉的 PPH-siALK 多聚復合物的靜電共組裝，實現針對 ALK+非小細胞肺癌的 siRNA 指導的吸入式 ALK 基因沉默。
為了應對ALK陽性肺癌治療的挑戰(zhàn)，研究人員通過邁克爾加成反應將聚β-氨基酯（PBAE）接枝到聚乙二醇（PEG）鏈段，并進一步引入組氨酸（His）以增強質子緩沖能力。核磁共振氫譜和二維相關譜驗證了合成步驟的完成，特征峰消失表明成功脫保護。傅里葉變換紅外光譜顯示PBAE和His的特征振動峰，進一步確認分子結構。凝膠滲透色譜測得不同分子量PPH（2k/5k/10k）的分散指數在1.36-1.86之間，證明聚合物均一性良好。pH滴定實驗表明PPH具有顯著的質子緩沖能力，在酸性條件下（pH~5.0）觸發(fā)電荷反轉，透光率測試顯示其pH響應性相變行為。該設計通過PEG的“隱形”效應與PBAE/His的電荷調控特性，實現了siRNA在生理環(huán)境中的穩(wěn)定包載及腫瘤微酸環(huán)境下的靶向釋放。
圖2. PPH的化學合成與表征。
通過TEM和動態(tài)光散射分析發(fā)現，不同分子量（2k/5k/10k）的PPH自組裝形成尺寸均一的納米顆粒。隨著N/P比從10增至40，復合物表面ζ電位由-15mV逆轉為+8mV，在pH5.0時進一步升至+12mV，展現顯著pH響應性電荷反轉特性。電泳遷移實驗證實PPH2k在N/P≥2時即可完全包裹siRNA，并能有效抵抗RNase I降解，證實了PPH可以在生理環(huán)境中有效保護siRNA并能在酸性的腫瘤微環(huán)境中打開并釋放siRNA。
圖3. PPH復合物的pH響應性、電荷反轉和核酸酶降解保護。
分子動力學模擬顯示，PPH與siRNA的結合穩(wěn)定性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)聚合物PEG-PBAE，PPH-siRNA體系的均方根偏差（RMSD）波動較小，且回旋半徑更小，表明其復合物結構更緊湊、結合更牢固（圖4）。通過拉伸分子動力學（SMD）模擬發(fā)現，PPH脫離siRNA所需外力峰值更高（0.4 ns時達最大值），且脫離后仍殘留組氨酸與siRNA的相互作用，證實其結合模式以鹽橋（磷酸骨架-胺基/咪唑環(huán)）和氫鍵（核堿基）為主。相比之下，PEG-PBAE因缺乏組氨酸的質子緩沖能力，與siRNA的靜電和疏水作用較弱，導致復合物穩(wěn)定性差。該結果從分子層面揭示了PPH通過雙正電荷模塊增強siRNA負載效率的機制，為其高效的pH響應釋放提供了理論依據。
圖4. 聚合物與siALK分子相互作用的分子動力學模擬。
進一步研究了PPH-siRNA復合物的體外轉染效率及體內藥代動力學特性。通過FITC標記siRNA的熒光成像和流式定量分析發(fā)現，隨著N/P比從20升至60，H3122細胞的轉染效率逐步提高，最終確定N/P=40為最優(yōu)配比。共聚焦圖片顯示，PPH-siRNA復合物在進入細胞后主要定位于溶酶體，但120分鐘后出現顯著的溶酶體逃逸現象，胞質內熒光呈現彌散分布，證實其pH響應特性可促進核酸釋放。藥代動力學研究顯示，吸入給藥的半衰期與靜脈注射相當，但生物分布特征顯著不同：吸入組在肺部呈現特異性累積，而靜脈注射組主要分布于肝臟。兩種給藥途徑的AUC0-48h均達到90 %ID·h/g以上，表明PPH載體系統(tǒng)通過吸入途徑既能維持系統(tǒng)暴露量，又可實現精準的肺部靶向遞送，為減少全身毒性提供了重要依據。
圖5. 復合物在H3122細胞中的轉染效率、藥物動力學與生物分布。
體外實驗顯示，PPH載體相較于傳統(tǒng)聚乙烯亞胺（PEI）展現出顯著降低的細胞毒性，同時能高效遞送siRNA實現靶向ALK基因沉默。該復合物通過特異性抑制ALK蛋白表達，有效阻斷下游PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的活化，從而顯著抑制腫瘤細胞的增殖能力、克隆形成潛力以及遷移侵襲特性。Western blot分析進一步證實，PPH介導的RNA干擾不僅選擇性降低ALK表達水平，還對MEK、ERK、AKT等關鍵信號分子的磷酸化具有顯著抑制作用，揭示了其通過多通路協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效應的分子機制。這些發(fā)現為PPH載體在基因治療中的高效性和安全性提供了重要實驗依據。
圖6. PPH2k介導的siRNA定向ALK基因沉默并抑制H3122細胞的生長。
在小鼠原位肺癌異種移植模型中，通過吸入給藥的PPH-siRNA復合物能有效靶向肺部腫瘤，顯著抑制ALK+ NSCLC腫瘤的生長并延長荷瘤小鼠生存期（圖7），同時通過系統(tǒng)性肺功能測試證實其對呼吸參數無明顯不良影響，未引發(fā)氣道阻塞或炎癥損傷，表明該吸入式基因療法在高效抑制腫瘤的同時具備良好的肺部安全性（圖8）。組織學分析證實其通過特異性抑制ALK表達及下游信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用，且未觀察到主要器官的病理損傷，表明該吸入式基因遞送系統(tǒng)兼具靶向性、有效性和生物安全性。
圖7. PPH遞送siALK抑制了H3122肺癌的生長。
圖8. PPH-siALK的治療有效緩解了肺癌模型小鼠的肺功能。
綜上所述，研究團隊通過設計pH響應型電荷反轉聚合物-siRNA復合物（PPH）并結合吸入式遞送策略，為ALK融合陽性非小細胞肺癌的RNA干擾治療提供了創(chuàng)新性解決方案，尤其在實現靶向遞送、增強siRNA穩(wěn)定性和克服傳統(tǒng)酪氨酸激酶抑制劑耐藥性方面，展現出了顯著的臨床轉化潛力。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2025.113644
通訊作者簡介
邢蔚，中山大學腫瘤防治中心手術麻醉科副主任，主任醫(yī)師、博士生導師，美國弗吉尼亞大學麻醉科訪問學者，以第一作者和通訊作者在Anesthesiology, British Journal of Anaesthesia等期刊發(fā)表論文30余篇，其中發(fā)表于Anesthesiology的論著成為當期封面。
