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  2025年3月，中山大學(xué)楊江研究員團(tuán)隊(duì)在《Journal of Controlled Release》上在線發(fā)表了題為《Inhalable pH-responsive charge-reversal polymer-small interfering RNA polyplexes for directed gene therapy of anaplastic lymphoma kinase fusion-positive lung cancer》研究性論文。該研究針對(duì)間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療挑戰(zhàn)，開(kāi)發(fā)了一種可吸入的pH響應(yīng)型電荷反轉(zhuǎn)聚合物-siRNA復(fù)合物（PPH）。傳統(tǒng)ALK酪氨酸激酶抑制劑存在耐藥性和副作用問(wèn)題，而RNA干擾（RNAi）技術(shù)因siRNA遞送效率低和穩(wěn)定性差難以應(yīng)用。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種由聚乙二醇（PEG）、聚β-氨基酯（PBAE）和組氨酸組成的PPH聚合物，通過(guò)靜電作用自組裝形成納米復(fù)合物。該載體在堿性胸膜液中保持負(fù)電荷以保護(hù)siRNA，在腫瘤微酸性環(huán)境中轉(zhuǎn)為正電荷，促進(jìn)細(xì)胞攝取和溶酶體逃逸。PPH-siRNA復(fù)合物在體外顯著提高siRNA穩(wěn)定性，在ALK⁺ NSCLC細(xì)胞（H3122）中，PPH介導(dǎo)的siALK遞送有效抑制ALK表達(dá)，阻斷下游MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路，并能顯著抑制原位肺癌異種移植瘤的生長(zhǎng)。該研究的創(chuàng)新性地將pH響應(yīng)電荷反轉(zhuǎn)機(jī)制與吸入式遞送相結(jié)合，解決了siRNA肺部遞送的關(guān)鍵難題，兼具靶向性、穩(wěn)定性和生物安全性，為RNAi治療ALK⁺ NSCLC提供了新策略，同時(shí)也為其他呼吸系統(tǒng)疾病的核酸藥物遞送開(kāi)辟了新路徑。這種非病毒載體平臺(tái)的技術(shù)突破，有望推動(dòng)基因治療在臨床中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

研究亮點(diǎn)

  （1）pH響應(yīng)電荷反轉(zhuǎn)遞送系統(tǒng)：開(kāi)發(fā)了PPH聚合物，該聚合物在堿性胸膜液中呈陰離子以保護(hù)siRNA，而在酸性腫瘤微環(huán)境中轉(zhuǎn)變?yōu)殛?yáng)離子，增強(qiáng)細(xì)胞攝取和溶酶體逃逸，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控釋。

  （2）高效基因沉默與低毒性：通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，PPH與siRNA形成穩(wěn)定復(fù)合物，體外轉(zhuǎn)染效率媲美商業(yè)PEI但毒性更低。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，吸入PPH-siALK顯著抑制ALK+肺癌生長(zhǎng)（腫瘤抑制率84.5%），并下調(diào)MAPK/PI3K-AKT信號(hào)通路。

  （3）非侵入性吸入給藥策略：首次實(shí)現(xiàn)siRNA的吸入式遞送，藥代動(dòng)力學(xué)表明藥物主要富集于肺部，減少全身暴露。呼吸功能測(cè)試證實(shí)治療改善肺通氣，且血液學(xué)與組織學(xué)評(píng)估顯示優(yōu)異生物安全性，為肺癌靶向治療提供新范式。

圖1. 通過(guò)雙正電荷的 PBAE 和 His 增強(qiáng)電荷反轉(zhuǎn)的 PPH-siALK 多聚復(fù)合物的靜電共組裝，實(shí)現(xiàn)針對(duì) ALK+非小細(xì)胞肺癌的 siRNA 指導(dǎo)的吸入式 ALK 基因沉默。

  為了應(yīng)對(duì)ALK陽(yáng)性肺癌治療的挑戰(zhàn)，研究人員通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)將聚β-氨基酯（PBAE）接枝到聚乙二醇（PEG）鏈段，并進(jìn)一步引入組氨酸（His）以增強(qiáng)質(zhì)子緩沖能力。核磁共振氫譜和二維相關(guān)譜驗(yàn)證了合成步驟的完成，特征峰消失表明成功脫保護(hù)。傅里葉變換紅外光譜顯示PBAE和His的特征振動(dòng)峰，進(jìn)一步確認(rèn)分子結(jié)構(gòu)。凝膠滲透色譜測(cè)得不同分子量PPH（2k/5k/10k）的分散指數(shù)在1.36-1.86之間，證明聚合物均一性良好。pH滴定實(shí)驗(yàn)表明PPH具有顯著的質(zhì)子緩沖能力，在酸性條件下（pH~5.0）觸發(fā)電荷反轉(zhuǎn)，透光率測(cè)試顯示其pH響應(yīng)性相變行為。該設(shè)計(jì)通過(guò)PEG的“隱形”效應(yīng)與PBAE/His的電荷調(diào)控特性，實(shí)現(xiàn)了siRNA在生理環(huán)境中的穩(wěn)定包載及腫瘤微酸環(huán)境下的靶向釋放。

圖2. PPH的化學(xué)合成與表征。

  通過(guò)TEM和動(dòng)態(tài)光散射分析發(fā)現(xiàn)，不同分子量（2k/5k/10k）的PPH自組裝形成尺寸均一的納米顆粒。隨著N/P比從10增至40，復(fù)合物表面ζ電位由-15mV逆轉(zhuǎn)為+8mV，在pH5.0時(shí)進(jìn)一步升至+12mV，展現(xiàn)顯著pH響應(yīng)性電荷反轉(zhuǎn)特性。電泳遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)PPH2k在N/P≥2時(shí)即可完全包裹siRNA，并能有效抵抗RNase I降解，證實(shí)了PPH可以在生理環(huán)境中有效保護(hù)siRNA并能在酸性的腫瘤微環(huán)境中打開(kāi)并釋放siRNA。

圖3. PPH復(fù)合物的pH響應(yīng)性、電荷反轉(zhuǎn)和核酸酶降解保護(hù)。

  分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，PPH與siRNA的結(jié)合穩(wěn)定性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)聚合物PEG-PBAE，PPH-siRNA體系的均方根偏差（RMSD）波動(dòng)較小，且回旋半徑更小，表明其復(fù)合物結(jié)構(gòu)更緊湊、結(jié)合更牢固（圖4）。通過(guò)拉伸分子動(dòng)力學(xué)（SMD）模擬發(fā)現(xiàn)，PPH脫離siRNA所需外力峰值更高（0.4 ns時(shí)達(dá)最大值），且脫離后仍殘留組氨酸與siRNA的相互作用，證實(shí)其結(jié)合模式以鹽橋（磷酸骨架-胺基/咪唑環(huán)）和氫鍵（核堿基）為主。相比之下，PEG-PBAE因缺乏組氨酸的質(zhì)子緩沖能力，與siRNA的靜電和疏水作用較弱，導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性差。該結(jié)果從分子層面揭示了PPH通過(guò)雙正電荷模塊增強(qiáng)siRNA負(fù)載效率的機(jī)制，為其高效的pH響應(yīng)釋放提供了理論依據(jù)。

圖4. 聚合物與siALK分子相互作用的分子動(dòng)力學(xué)模擬。

  進(jìn)一步研究了PPH-siRNA復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染效率及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特性。通過(guò)FITC標(biāo)記siRNA的熒光成像和流式定量分析發(fā)現(xiàn)，隨著N/P比從20升至60，H3122細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率逐步提高，最終確定N/P=40為最優(yōu)配比。共聚焦圖片顯示，PPH-siRNA復(fù)合物在進(jìn)入細(xì)胞后主要定位于溶酶體，但120分鐘后出現(xiàn)顯著的溶酶體逃逸現(xiàn)象，胞質(zhì)內(nèi)熒光呈現(xiàn)彌散分布，證實(shí)其pH響應(yīng)特性可促進(jìn)核酸釋放。藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，吸入給藥的半衰期與靜脈注射相當(dāng)，但生物分布特征顯著不同：吸入組在肺部呈現(xiàn)特異性累積，而靜脈注射組主要分布于肝臟。兩種給藥途徑的AUC_0-48h均達(dá)到90 %ID·h/g以上，表明PPH載體系統(tǒng)通過(guò)吸入途徑既能維持系統(tǒng)暴露量，又可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的肺部靶向遞送，為減少全身毒性提供了重要依據(jù)。

圖5. 復(fù)合物在H3122細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率、藥物動(dòng)力學(xué)與生物分布。

  體外實(shí)驗(yàn)顯示，PPH載體相較于傳統(tǒng)聚乙烯亞胺（PEI）展現(xiàn)出顯著降低的細(xì)胞毒性，同時(shí)能高效遞送siRNA實(shí)現(xiàn)靶向ALK基因沉默。該復(fù)合物通過(guò)特異性抑制ALK蛋白表達(dá)，有效阻斷下游PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路的活化，從而顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力、克隆形成潛力以及遷移侵襲特性。Western blot分析進(jìn)一步證實(shí)，PPH介導(dǎo)的RNA干擾不僅選擇性降低ALK表達(dá)水平，還對(duì)MEK、ERK、AKT等關(guān)鍵信號(hào)分子的磷酸化具有顯著抑制作用，揭示了其通過(guò)多通路協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為PPH載體在基因治療中的高效性和安全性提供了重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖6. PPH2k介導(dǎo)的siRNA定向ALK基因沉默并抑制H3122細(xì)胞的生長(zhǎng)。

  在小鼠原位肺癌異種移植模型中，通過(guò)吸入給藥的PPH-siRNA復(fù)合物能有效靶向肺部腫瘤，顯著抑制ALK⁺ NSCLC腫瘤的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期（圖7），同時(shí)通過(guò)系統(tǒng)性肺功能測(cè)試證實(shí)其對(duì)呼吸參數(shù)無(wú)明顯不良影響，未引發(fā)氣道阻塞或炎癥損傷，表明該吸入式基因療法在高效抑制腫瘤的同時(shí)具備良好的肺部安全性（圖8）。組織學(xué)分析證實(shí)其通過(guò)特異性抑制ALK表達(dá)及下游信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用，且未觀察到主要器官的病理?yè)p傷，表明該吸入式基因遞送系統(tǒng)兼具靶向性、有效性和生物安全性。

圖7. PPH遞送siALK抑制了H3122肺癌的生長(zhǎng)。

圖8. PPH-siALK的治療有效緩解了肺癌模型小鼠的肺功能。

  綜上所述，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)設(shè)計(jì)pH響應(yīng)型電荷反轉(zhuǎn)聚合物-siRNA復(fù)合物（PPH）并結(jié)合吸入式遞送策略，為ALK融合陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌的RNA干擾治療提供了創(chuàng)新性解決方案，尤其在實(shí)現(xiàn)靶向遞送、增強(qiáng)siRNA穩(wěn)定性和克服傳統(tǒng)酪氨酸激酶抑制劑耐藥性方面，展現(xiàn)出了顯著的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2025.113644

通訊作者簡(jiǎn)介

  邢蔚，中山大學(xué)腫瘤防治中心手術(shù)麻醉科副主任，主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師，美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)麻醉科訪問(wèn)學(xué)者，以第一作者和通訊作者在Anesthesiology, British Journal of Anaesthesia等期刊發(fā)表論文30余篇，其中發(fā)表于Anesthesiology的論著成為當(dāng)期封面。