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  近年來，蛋白或基于蛋白的診療試劑（PBTA）受到越來越多科研工作者的關(guān)注。這其中，包括治療蛋白如細(xì)胞因子、單抗、生物酶等，可以作為生物大分子藥物，在抗腫瘤治療中表現(xiàn)出優(yōu)良的活性。另外一些則是生物相容性蛋白，如白蛋白、血紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等，可以作為治療性小分子藥物、染料或診斷劑的載體。然而，目前已報(bào)道的蛋白診療劑由于其在腫瘤中蓄積、滲透或選擇性差等種種問題，很大程度上限制了其體內(nèi)應(yīng)用以及臨床轉(zhuǎn)化。我們知道，納米粒子的粒徑在腫瘤滯留、滲透中扮演著至關(guān)重要的角色。通常來講，粒徑較小的納米粒子具有較強(qiáng)的滲透能力，卻同時(shí)伴隨著較差的腫瘤滯留；而粒徑較大的粒子恰恰相反，表現(xiàn)出較強(qiáng)滯留及較差滲透。目前已開發(fā)的大部分蛋白診療試劑粒徑均分布在2-20 nm，該小粒子很容易通過腎清除排出體內(nèi)，其體內(nèi)生物半衰期不到1小時(shí)，使得療效大打折扣。

  近期，中國藥科大學(xué)藥學(xué)院孫敏捷教授團(tuán)隊(duì)利用動(dòng)態(tài)組裝技術(shù)，開發(fā)出一種細(xì)胞外微環(huán)境ATP超敏蛋白團(tuán)簇（DEP/GdCuB）成功攻克這一瓶頸，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了蛋白粒子在腫瘤部位有效蓄積及深層滲透，并用于放大T₁加權(quán)磁共振成像（MRI）引導(dǎo)的光熱治療（圖1）。這一成果近日發(fā)表于Advanced Functional Materials雜志。

圖1. 胞外ATP超敏型蛋白團(tuán)簇（DEP/GdCuB）制備及在體內(nèi)工作原理示意圖：（A）在血液循環(huán)中：將荷載Gd和CuS的白蛋白納米小粒子（9 nm）制備成蛋白團(tuán)簇（120 nm），能夠有效延長蛋白的血液循環(huán)時(shí)間，從而增強(qiáng)其在腫瘤部位蓄積，與此同時(shí)，制備成較大粒子能夠減弱Gd的T₁加權(quán)MRI效果，降低背景信號(hào)；（B）當(dāng)?shù)鞍讏F(tuán)簇到達(dá)腫瘤部位，腫瘤微環(huán)境0.1-0.4mM ATP能夠迅速反轉(zhuǎn)DEP陽離子材料電荷，觸發(fā)蛋白小粒子釋放，實(shí)現(xiàn)深層滲透的同時(shí)，“大變小”策略激活Gd的T₁加權(quán)MRI成像，點(diǎn)亮腫瘤，實(shí)現(xiàn)MRI引導(dǎo)的光熱治療。

  腫瘤微環(huán)境（0.1-0.4 mM）及腫瘤細(xì)胞內(nèi)（1-10 mM）均富含ATP分子，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ATP分子中同時(shí)包含能與苯硼酸（PBA）特異結(jié)合的二醇分子以及強(qiáng)負(fù)電性三磷酸分子，修飾苯硼酸的陽離子聚合物能夠在富含ATP環(huán)境下迅速實(shí)現(xiàn)電荷反轉(zhuǎn)（正轉(zhuǎn)負(fù)），通過靜電排斥觸發(fā)負(fù)電性siRNA釋放。基于上述概念，孫敏捷教授團(tuán)隊(duì)成功開發(fā)出能夠針對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度ATP選擇性激活的siRNA轉(zhuǎn)染載體（ACS Appl. Mater. Interfaces 2018, 10, 32026?32037；Theranostics 2018; 8(17): 4604-4619）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，很多生物大分子藥物，如蛋白中也包含負(fù)電性區(qū)域，因此，該ATP敏感體系在蛋白遞送中是否同樣具有應(yīng)用前景值得進(jìn)一步探究。

  首先，該團(tuán)隊(duì)在天然多糖糊精上修飾乙二胺作為陽離子材料，同時(shí)修飾不同取代度的苯硼酸，以調(diào)節(jié)ATP敏感性，得到ATP敏感載體DEP。將Gd和CuS分別作為MRI成像模塊以及光熱治療元件包載在BSA納米粒中，形成診療一體化蛋白小粒子（GdCuB）。蛋白小粒子包裹在DEP材料中，形成蛋白團(tuán)簇DEP/GdCuB。最終通過篩選，選取較高PBA取代度的DEP材料用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明其具有ATP超敏感性能，能夠快速響應(yīng)腫瘤微環(huán)境0.1 mM ATP。如圖2A所示，加入ATP后，DEP發(fā)生電荷反轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致GdCuB蛋白的快速釋放（圖2B）。從TEM形貌觀察中也能發(fā)現(xiàn)，GdCuB為9 nm，DEP/GdCuB為120 nm左右，同時(shí)，在團(tuán)簇中加入ATP后, 大量小粒子從團(tuán)簇中釋放（圖2C），證明了ATP可觸發(fā)團(tuán)簇解體及蛋白釋放。通常來講，將T₁成像劑Gd包載在小粒徑BSA中，由于其具有較大的比表面積，能夠大大縮短弛豫時(shí)間，因此具有很  好的成像效果；而形成團(tuán)簇之后，比表面積減小，Gd離子與水分子接觸幾率降低，成像效果減弱。這里，通過血液循環(huán)中“小變大”和腫瘤微環(huán)境“大變小”的動(dòng)態(tài)組裝策略，能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤區(qū)域ATP選擇性激活T₁成像效果（圖3A，3B）。更值得一提的是，“小變大”與“大變小”的動(dòng)態(tài)組裝能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤的蓄積與深層滲透（圖3C）。此項(xiàng)研究工作不僅提供了一種平衡納米粒子在腫瘤滲透及滯留的新策略，而且為下一代蛋白診療試劑的開發(fā)提供了一個(gè)實(shí)例，對(duì)優(yōu)化蛋白診療試劑的臨床應(yīng)用具有重要的參考意義。此外，該策略是否能夠普適的應(yīng)用于表面負(fù)電性修飾的納米粒子（如：Fe₃O₄， 金納米，量子點(diǎn)等），仍然值得進(jìn)一步探究。

圖2. （A）ATP觸發(fā)陽離子材料DEP電荷反轉(zhuǎn)示意圖；（B）ATP觸發(fā)蛋白小粒子GdCuB釋放；（C）TEM觀察蛋白小粒子和蛋白團(tuán)簇形態(tài)，以及加入ATP后團(tuán)簇形態(tài)變化。

圖3. （A）不同濃度GdCuB、DEP/GdCuB以及DEP/GdCuB+ATP溶液的T₁加權(quán)磁共振成像；（B）T₁加權(quán)磁共振成像弛豫系數(shù)計(jì)算；（C）3D腫瘤細(xì)胞球觀察DEP/GdCuB-FITC蛋白團(tuán)簇在有無ATP存在下的滲透。

  中國藥科大學(xué)博士生周占威為本論文第一作者，孫敏捷教授為本文的通訊作者。

  該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“納米專項(xiàng)”（2017YFA0205402）、國家自然科學(xué)基（81872817, 81573377, 81803477）、江蘇省杰出青年基金（BK20170028）等資助。

  論文題目為“Size Switchable Nanoclusters Fueled by Extracellular ATP for Promoting the Deep Penetration and MRI Guided Tumor Photothermal Therapy”https://doi.org/10.1002/adfm.201904144