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  癌癥的特征是多種遺傳改變或突變所引起的異常代謝和增殖。腫瘤細胞在藥物代謝過程的基因突變或藥物靶點的修復(fù)可引起細胞對傳統(tǒng)療法的耐受。最近，一種新型的簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)酶（Cas）， Cas13a（以前稱為C2c2）被鑒定為RNA導(dǎo)向的靶向RNA的CRISPR效應(yīng)子。Cas13a / CRISPR RNA（crRNA）復(fù)合物在靶標目的RNA后同樣會激活一般的RNase活性，導(dǎo)致細胞RNA的非特異性裂解，并最終導(dǎo)致程序性細胞死亡或休眠（即“附帶效應(yīng)”）。這種獨特的“附帶效應(yīng)”自動繞過了實體瘤對傳統(tǒng)療法的復(fù)雜耐藥性和逃逸機制，從而使CRISPR / Cas13a系統(tǒng)成為癌癥治療的理想治療劑，具有降低有效劑量和最小化的耐藥性的潛能。

  但是，這種“附帶效應(yīng)”并不是專門針對腫瘤細胞的，因為一旦任何細胞的RNA達到與Cas13a/crRNA復(fù)合物的互補結(jié)合，它就可以被激活。當全身施用基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的藥物時，可能會導(dǎo)致與腫瘤以外的組織中不希望的細胞死亡有關(guān)的安全性問題。因此，僅在腫瘤細胞中限制CRISPR / Cas13a系統(tǒng)激活的可行策略對于基于CRISPR/ Cas13a的藥物在癌癥治療中的安全應(yīng)用至關(guān)重要。

圖1. DLNP用于有效癌癥免疫治療的示意圖。類似于僅在兩個鎖都解鎖時才能打開的雙鎖保險箱，DLNP只能在低pHe和高H₂O₂濃度同時存在的微環(huán)境中釋放CRISPR /Cas13a系統(tǒng)。

  近來，南開大學(xué)劉陽研究員和史林啟教授團隊聯(lián)合天津醫(yī)科大學(xué)康春生教授團隊合作在Advanced materials上發(fā)表文章，提出了一種可以限制CRISPR/Cas13a激活至腫瘤組織的雙鎖納米顆粒（DLNP）。DLNP具有核-殼結(jié)構(gòu)。在血液循環(huán)或正常組織中，聚合物層賦予DLNP帶負電荷的聚乙二醇化表面，可有效維持其循環(huán)穩(wěn)定性。到達腫瘤微環(huán)境后，聚合物層降解為陽離子聚合物，從而促進CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的細胞內(nèi)在化和基因編輯的激活。類似于雙鎖保險箱，只有在低pHe和高H₂O₂濃度的微環(huán)境中，DLNP才能釋放CRISPR/Cas13a系統(tǒng)。

  在這項研究中，選擇靶向PD-L1基因的crRNA作為模型crRNA。通過精準控制CRISPR/Cas13a激活，DLNP成功地在腫瘤中富集并誘導(dǎo)PD-L1陽性的腫瘤細胞死亡和免疫系統(tǒng)的活化。南開大學(xué)博士研究生張展展為本論文的第一作者，論文通訊作者為劉陽研究員、史林啟教授和康春生教授。

圖2. DLNP, H₂O₂-NP和pH-NP的結(jié)構(gòu)表征

  如圖2a所示，雙鎖納米粒子DLNP通過兩步法制備完成，其中編碼CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的pDNA被負載在納米粒子的核內(nèi)，并由pH和H₂O₂雙響應(yīng)的聚合物殼層所包裹。研究人員通過zeta電位，表面非特意性蛋白吸附，熒光能量共振轉(zhuǎn)移以及細胞攝取等實驗，證明了雙鎖納米粒子的pH和H₂O₂雙特異性。

圖3. DLNP, H₂O₂-NP和pH-NP的生物功能表征

  研究人員隨后選擇針對PD-L1的crRNA作為模型RNA對DLNP， H₂O₂-NP和pH-NP的生物功能進行研究，如果3所示，經(jīng)DLNP處理的B16F10（a）和GL261（b）細胞的核糖體RNA在pH 6.8/H₂O₂下顯示出類似的裂解趨勢，而在DLNP處理的4T1細胞（c）中未觀察到RNA裂解。表明誘導(dǎo)RNA切割時DLNP的TME和PD-L1雙重特異性。進一步的細胞活性實驗也證實了這些結(jié)果。

圖4. DLNP, H₂O₂-NP和pH-NP體內(nèi)抑瘤效果

  隨后，研究人員對三種納米粒子的體內(nèi)抑瘤效果進行了研究，如圖4所示，相較于H₂O₂-NP和pH-NP，DLNP可以有效抑制腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存周期，提高TNF-α, IFN-γ和IL-2的表達量并可有效提高腫瘤內(nèi)CD8+ T細胞的浸潤。表明DLNP可以有效擾亂PD-1/PD-L1通路，并實現(xiàn)對T細胞介導(dǎo)的抑瘤活性的恢復(fù)。

圖5. DLNP在CD8⁺T細胞阻斷模型和4T1 / B16F10共存模型中的體內(nèi)抑瘤效果。

  最后，研究人員利用aCD8a對小鼠體內(nèi)的效應(yīng)T細胞進行阻斷來研究DLNP的體內(nèi)作用機制，如圖5a所示，在T細胞阻斷的小鼠中，DLNP的抑瘤效果和對小鼠的生存周期影響大幅度下降，表明DLNP是通過對T細胞的激活來完成對腫瘤生長的抑制。隨后，研究人員在4T1 / B16F10共存的小鼠中對DLNP的抑瘤效果進行分析，結(jié)果表明DLNP可以選擇性殺傷高表達PD-L1的腫瘤細胞而對低表達的4T1則無明顯效果。對CD8的分析數(shù)據(jù)同樣表明該結(jié)果。

  考慮到免疫效應(yīng)細胞抑制途徑的多樣性，可以通過替換特異性crRNA的靶向基因而進行的進一步開發(fā)可能使DLNP成為快速開發(fā)安全有效的癌癥免疫療法的通用平臺。

  論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.201905751