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南華大學魏華/喻翠云教授團隊 AHM：具有清除ROS、改善損傷線粒體和促血管生成的多功能可注射水凝膠用于心肌梗死治療
2022-07-21  來源：高分子科技

  心血管疾病尤其是急性心肌梗死（AMI）和心力衰竭（HF）等近年來已成為導致人類死亡的主要原因之一。盡管傳統(tǒng)的MI臨床治療方法，包括介入療法和藥物治療可以改善心功能和延長患者預期壽命，但仍存在不可逆的心肌壞死或心功能逐漸衰退。作為人體中代謝最活躍的器官，心臟擁有所有組織中最高的線粒體含量，消耗每天產(chǎn)生總ATP的8%。在AMI患者中，缺血剝奪了心肌細胞氧氣和營養(yǎng)的供應，首先觸發(fā)心肌細胞中線粒體功能或ATP的代謝紊亂。異常線粒體功能是活性氧（ROS）產(chǎn)生的一個主要來源，它可以通過釋放細胞色素c到胞漿，隨后激活Caspases信號通路來直接促進心肌細胞程序性死亡。在心肌損傷情況下，ROS的產(chǎn)生不受控制，導致ROS水平異常升高，加劇MI向HF的發(fā)展。盡管在過去的20年里，人們?yōu)殚_發(fā)能夠特異靶向線粒體治療心血管疾病的藥物做出了巨大的努力，但是大多數(shù)報道的ROS清除劑在臨床心血管疾病研究上未取得明顯效果，這可能是由于用抗氧化劑進行無差別的治療會消除適當水平的生理ROS，而這些ROS對生理信號傳導和功能保護是必不可少的。因此，理想的治療策略應該是用一種能夠針對受損線粒體的藥物選擇性地防止病理性ROS的產(chǎn)生，而不完全消除正常功能所需的ROS。


  近日，南華大學藥學院魏華教授和喻翠云教授課題組，通過開發(fā)了一種具有清除ROS、改善損傷線粒體和促血管生成的多重功能可注射水凝膠，來實現(xiàn)對MI的治療（圖1）。該水凝膠是由聚3-氨基-4-甲氧基苯甲酸（PAMB）和雙氨基縮硫酮（TK-NH2）修飾明膠得到PAMB-G-TK與4-臂-聚乙二醇-琥珀酰亞胺戊二酸酯（4-arm-PEG-SG）在溫和的條件下快速形成所制，它們敏感的縮硫酮鍵交聯(lián)位點被用來消耗ROS和解交聯(lián)釋放S1P（1-磷酸-鞘氨醇）和SS-31負載的脂質(zhì)體（S1P/SS-31/Lipo）。S1P/SS-31/Lipo中SS-31作為靶向改善線粒體氧化損傷的多肽抑制劑，S1P作為激活血管生成的信號分子。優(yōu)化產(chǎn)生的PAMB-G-TK/4-arm-PEG-SG水凝膠表現(xiàn)出心肌樣的機械強度和導電性，并具有ROS觸發(fā)的S1P/SS-31/Lipo釋放效果。更重要的是，脂質(zhì)體釋放負載的SS-31可以靶向受損心肌細胞線粒體內(nèi)膜的心磷脂，抑制病理性ROS的產(chǎn)生，從而改善線粒體功能。同時，來自脂質(zhì)體的S1P可以通過激活S1PR1/PI3K/Akt途徑促進內(nèi)皮細胞的血管生成。在大鼠MI模型中，所開發(fā)的水凝膠能清除多余的ROS，改善線粒體功能障礙，促進血管生成，從而改善心臟功能。該研究首次揭示了通過脂質(zhì)體和水凝膠的整合，直接靶向受損的心肌細胞線粒體進行反饋調(diào)節(jié)，以防止病理性ROS的產(chǎn)生和促進血管生成，從而改善心肌活性，更有效地治療MI。

 

圖1. S1P/SS-31/Lipo負載ROS響應水凝膠用于MI治療的機制示意圖。


圖2. 水凝膠配方的優(yōu)化和表征。A）不同比例水凝膠的凝膠化時間（n = 3）。B）水凝膠的優(yōu)良可塑性。C）水凝膠的SEM和S1P/SS-31/Lipo負載水凝膠的SEM。D）水凝膠的壓縮性。E, F）水凝膠樣品的流變學特性，時間掃描和頻率掃描。G）水凝膠樣品的機械性能。


  緩慢的凝膠化時間可能導致水凝膠的前驅(qū)液由于心臟的持續(xù)跳動而大量流失，而快速的凝膠化時間容易導致水凝膠在注射過程中堵塞針頭。在這項研究中，水凝膠的凝膠化時間是通過倒置法來評估的。首先通過4-arm-PEG-SG與PAMB-G-TK之間不同的投料比來評估水凝膠的凝膠時間（圖2A）。這里，成分為3% PAMB-G-TK和1.5% 4-arm-PEG-SG的水凝膠前驅(qū)液顯示了約30-50s的凝膠時間，適合于隨后的梗死動物模型心肌內(nèi)注射。另外，該水凝膠具有良好的可塑性，通過相關(guān)磨具可以制成各種形狀的外觀（圖2B）。為了觀察該水凝膠的微觀形貌，SEM檢測了3% 4-arm-PEG-SG/1.5% PAMB-G-TK水凝膠，顯示該水凝膠呈現(xiàn)均勻的三維多孔網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，并且S1P/SS-31/Lipo可以均勻地被包裹在水凝膠中（圖2C）。將此比例的水凝膠樣品進行外部壓縮測試，水凝膠在近體積的50%下壓縮測試中不損壞，暗示良好的力學性能（圖2D）。


  在MI的早期階段，心肌壁的硬度約為4 - 17 kPa，隨后在心肌的逐漸纖維化，心肌壁的彈性模量增加到45 ± 15 kPa。首先比較了幾種不同配比的水凝膠流變學特性。在時間掃描模式下，三個樣品的水凝膠儲存模量（G''）和損失模量（G''''）在20 min內(nèi)被測定。隨著高分子材料比例的增加，水凝膠的模量明顯增加（圖2E），表明力學性能逐漸增強。為了評估水凝膠的穩(wěn)定性，監(jiān)測了G''和G''''在0.1到10 Hz的不同頻率下變化（圖2F）。在整個檢查的頻率范圍內(nèi)，G''一致地支配著G''''，表明所有測試的樣品都有類似于彈性固體的行為。這里，根據(jù)不同配方的應力-應變曲線（圖2G），3% PAMB-G-TK/1.5% 4-arm-PEG-SG的比例水凝膠楊氏模量約28 kPa，表明該水凝膠可以作為心肌組織的支撐材料。 


圖3. S1P/SS-31/Lipo對氧化損傷心肌細胞線粒體的影響。A）S1P/SS-31/Lipo治療心肌細胞線粒體損傷的作用機制示意圖。B,C）Western blot分析心肌細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax/Cleaved caspase-3和Cyt c的表達水平。D）TEM檢測經(jīng)處理后心肌細胞線粒體的結(jié)構(gòu)形態(tài)。比例尺：500 nm，放大后比例尺：50 nm。E）JC-1檢測不同樣品處理后心肌細胞的線粒體膜電位。比例尺：150 μm。F）定量分析膜電位光密度值。（n = 3，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。


  SS-31（elamipretide；D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2）是一種線粒體靶向抗氧化肽，主要通過與心磷脂相互作用來阻斷ROS介導的心磷脂氧化和隨后的能量損失的惡性循環(huán)。為了探究S1P/SS-31/Lipo負載水凝膠對氧化損傷心肌細胞的治療機制，探究了S1P/SS-31/Lipo對ROS誘導的心肌細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、caspase-3以及線粒體內(nèi)的Cyt c水平，結(jié)果表明S1P/SS-31/Lipo可以通過抑制線粒體細胞色素C的釋放，抑制ROS產(chǎn)生，改善心肌細胞活性。另外，TEM發(fā)現(xiàn)H2O2誘導導致心肌細胞線粒體外膜通透性和膜結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷，但通過使用SS-31/Lipo或S1P/SS-31/Lipo處理后，線粒體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)修復的趨勢，這進一步證明了攜帶SS-31的脂質(zhì)體確實具有改善線粒體損傷的效果（圖3D）。JC-1試劑盒檢測心肌細胞接種不同水凝膠樣品中的線粒體膜電位影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2組綠色熒光MOD值明顯升高，表明線粒體功能損傷，將心肌細胞接種在SS-31/Lipo或S1P/SS-31/Lipo水凝膠后，線粒體膜電位損失顯著減少，進一步驗證了上述研究得到的結(jié)果（圖3E,F）。


圖4. 治療28天后梗死心肌的結(jié)構(gòu)和功能影響。A）MI大鼠的水凝膠處理實驗的時間軸。B）治療后28天，梗死邊界和梗死核心區(qū)的H&E染色。C）治療28天后，梗死邊界和梗死核心區(qū)的Masson染色。D）不同樣品治療28天后梗死壁厚度的定量分析。E）不同樣品治療28天后梗死面積的定量分析。（比例尺：5 mm；放大后比例尺：500 μm。）F）不同治療組的代表性超聲心動圖圖像。G）EF，H）FS，I）LVIDD，和J）LVIDS的定量分析。(n = 3，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。


  為了盡可能多的將水凝膠覆蓋梗死的心肌區(qū)域，100 μL水凝膠通過5次（每次20 μL）注射到SD大鼠MI區(qū)的五個部位。圖4A顯示了SD大鼠體內(nèi)實驗的時間線。經(jīng)典的染色方法，H&E和Masson被用來評估受損心臟的微觀結(jié)構(gòu)。染色結(jié)果顯示鹽水組出現(xiàn)大面積的心肌塌陷、梗死纖維化的形成、藍色膠原蛋白的沉積（圖4），表明存在嚴重的MI。需要注意的是，使用S1P/Lipo水凝膠或SS-31/Lipo水凝膠治療組中纖維化面積得到了適當?shù)囊种疲湟种菩Ч蝗?/span>S1P/SS-31/Lipo水凝膠組。另外，超聲心動圖（ECHO）檢查了不同水凝膠處理組對左心室功能的影響。結(jié)果顯示S1P/SS-31/Lipo負載水凝膠組的EF和FS的治療效果進一步提高，并顯示出對心肌幾何形狀的最佳維持和改善。


  該項成果以“A ROS-Responsive Liposomal Composite Hydrogel Integrating Improved Mitochondrial Function and Pro-angiogenesis for Efficient Treatment of Myocardial Infarction”為題發(fā)表在Advanced Healthcare Materials期刊上。課題組博士研究生鄭治為本論文的第一作者，通訊作者為魏華教授和喻翠云教授。另外，該科研團隊近期還發(fā)展了一種同時負載按需釋放促血管生成肽和人骨髓間充質(zhì)干細胞的雙重交聯(lián)的可注射導電水凝膠，實現(xiàn)了心肌梗死全階段的高效治療，在J. Controlled Release（2022, 347, 127-142.）上發(fā)表了題為“A Dual Crosslinked Hydrogel-Mediated Integrated Peptides and BMSC Therapy for Myocardial Regeneration”的研究論文。同時，該團隊還提出并系統(tǒng)總結(jié)了導電水凝膠作為電活性組織工程支架用于心肌梗塞治療的新策略（J. Controlled Release, 2021, 335, 216-236.）上。該研究得到了國家自然科學基金（81471777）、湖南省自然科學基金（2017JJ1024）和湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX20200911）的支持。


  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adhm.202200990

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（責任編輯：xu）
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