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青島大學周祺惠/山東省立醫(yī)院傅強《Carbohyd. Polym.》：負載外泌體的可注射溫敏水凝膠用于治療神經(jīng)損傷性勃起功能障礙
2022-11-13  來源：高分子科技

  盆腔根治性手術(shù)是盆腔腫瘤的基本治療方法，但其術(shù)后常伴有因海綿體神經(jīng)損傷造成的勃起功能障礙（CNI-ED）等并發(fā)癥，嚴重影響患者術(shù)后生活質(zhì)量。臨床上，ED的治療方案主要涉及磷酸二酯酶5抑制劑（PDE5is）使用、體內(nèi)注射療法（ICIS）和真空勃起裝置（VED）介入等，但這些方案對CNI-ED的治療低效。在該背景下，陰莖假體植入手術(shù)成為CNI-ED患者的臨床選擇。然而，作為一種侵入性治療策略，陰莖假體植入手術(shù)昂貴的治療費用和存在的機械故障/感染等潛在風險限制了其臨床應用的推廣。因此，尋找一種新型非侵入的、治療效果顯著的CNI-ED治療方法具有非常重要的臨床價值。


  近年來，干細胞及其衍生的外泌體被廣泛用于CNI-ED治療，且已證實間質(zhì)干細胞（MSC）衍生的外泌體（MSC-Exo）療法有潛力治愈神經(jīng)退行性疾病。即便如此，MSC-Exo治療策略仍存在半衰期短、易被免疫系統(tǒng)快速清除等局限性。鑒于受傷組織修復的復雜過程，如何提高外泌體體內(nèi)的穩(wěn)定性和作用持久性成為修復神經(jīng)損傷的關(guān)鍵問題。


  基于此，青島大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院周祺惠團隊和山東省立醫(yī)院泌尿外科傅強團隊基于羥乙基殼聚糖（HECTS）和β-甘油磷酸鈉（β-GP）制備了一種新型負載脂肪間充質(zhì)干細胞（ADSCs）來源外泌體（Exo）的可注射溫敏性水凝膠（HG@Exo），并用于CNI-ED疾病的治療（圖1）。結(jié)果證實：1）ADSC-Exo顯著促進施萬細胞（SCs）神經(jīng)營養(yǎng)因子表達和誘導神經(jīng)損傷修復；2）溫敏性水凝膠HG成功實現(xiàn)ADSC-Exo的局部緩釋，并增強其作用持久性；3）HG@Exo成功改善BCNI大鼠的勃起功能障礙。綜上所述，HG@Exo對于治療和預防術(shù)中神經(jīng)損傷引起的ED具有巨大潛力。簡要內(nèi)容如下： 


圖1. HG@Exo用于治療CNI-ED示意圖。


1.溫敏性水凝膠HG制備工藝簡單、凝膠化溫度/時間適宜


  本研究成功分離出ADSC-Exo（圖2A-C），并證實溫敏性水凝膠HG的制備工藝簡單可行（圖2D）。FTIR結(jié)果證實HG的形成與HECTS分子鏈N-H基和β-GP分子鏈O-H基間形成的氫鍵有關(guān)（圖2E）。SEM觀察到HG內(nèi)部具有孔徑均勻、孔隙連貫的多孔結(jié)構(gòu)（圖2F）。流變檢測出HG凝膠化溫度為28.4℃，凝膠化時間為4分鐘（圖2G）。此外，本研究還證實HG具有優(yōu)異的可注射性（圖2H），方便臨床過程中的微創(chuàng)使用。 


圖2. （A-B）外泌體形貌和粒徑分布；（C）外泌體標志蛋白CD9、CD63和TSG101的表達；（D-F）HG的合成，F(xiàn)TIR光譜和內(nèi)部形貌；（G）HG在不同溫度和時間下的流變力學；（H）HG可注射性。


2.溫敏性水凝膠HG可增強ADSC-Exo的局部緩釋和作用持久性


  本研究將HG@Exo水凝膠應用于BCNI大鼠神經(jīng)損傷模型（圖3A），證實HG@Exo水凝膠組外泌體在大鼠神經(jīng)損傷部位的保留時間明顯長于PBS-Exo組，且能清晰地觀察到熒光信號（圖3B），表明新型溫敏性水凝膠HG可以顯著增強ADSC-Exo在損傷部位的緩釋和作用持久性。 


圖3.（A）HG@Exo水凝膠應用于BCNI大鼠神經(jīng)損傷模型示意圖；（B）DiR標記的外泌體體內(nèi)實時監(jiān)測。


3.HG可增強外泌體對CNI-ED的治療作用、提高BCNI大鼠的勃起功能


  采用HG@Exo水凝膠治療模型大鼠的勃起功能，4周后發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組、BCNI組、HG@Exo組、PBS-Exo組和HG組的最大顱內(nèi)壓/平均動脈壓比值分別為0.87 ± 0.04、0.39 ± 0.02、0.65 ± 0.05、0.44 ± 0.03、0.52 ± 0.04（圖4A-F）。這不僅說明BCNI會導致ED，也證實HG@Exo能顯著提高BCNI大鼠的勃起功能。 



圖4. HG@Exo水凝膠治療模型大鼠的勃起功能評估：（A-E）ICP曲線。紅條表示在60 s內(nèi)對CN進行電刺激的時間；（F）最大ICP與MAP比率。


  為了檢測HG@Exo水凝膠治療CNI-ED有效性的原因，本研究進行了體外細胞實驗？紤]到HG@Exo水凝膠換液和室溫觀察的不便性，本研究直接選擇了ADSC-Exo進行體外培養(yǎng)干預。圖5A-C是海綿體神經(jīng)/盆腔神經(jīng)節(jié)（CN/MPG）的解剖結(jié)構(gòu)和體外培養(yǎng)步驟。經(jīng)治療后對24、48和72小時的CN/MPG終末突起生長的數(shù)目和長度進行測量（圖5D），證實ADSC-Exo顯著促進了軸突的生長（圖5E-F）。經(jīng)分析ADSCs和ADSC-Exo作用4周后CN/MPG中nNOS的表達情況，也發(fā)現(xiàn)ADSC-Exo處理組的nNOS表達明顯高于對照組和ADSCs+GW4869組（圖5G-H）。 



圖5. （A）CN/MPG解剖結(jié)構(gòu)和體外培養(yǎng)；（B）CN/MPG解剖圖；（C）培養(yǎng)0（i）、24（ii）、48 h（iii）后神經(jīng)元的生長情況。iv和v是iii的放大圖；（D）神經(jīng)元外植體；（E-F）外泌體和ADSCs促神經(jīng)元生長情況；（G）CN/MPG中nNOS的表達情況；（H）nNOS與β-肌動蛋白的比例。


4.ADSC-Exo通過促進SCs的存活增強神經(jīng)損傷的修復


  為探討ADSC-Exo促進神經(jīng)軸突再生的機制，本研究從SD大鼠坐骨神經(jīng)中分離出SCs（圖6A-B）。結(jié)果證實，ADSC-Exo可使EDU陽性率從23.12 ± 1.04%增加到35.76 ± 1.61%（圖6C）。對照組H3P摻入量為3.54 ± 0.11%，而ADSC-Exo干預后提升到8.15 ± 0.22%（圖6D）。外源性ADSC-Exo也可顯著降低SCs的凋亡率（圖6E）；蚪Y(jié)果證實，ADSC-Exo可顯著促進SCs的神經(jīng)營養(yǎng)因子表達（圖6F-H）。這些結(jié)果均表明，ADSC-Exo可通過促進SCs的存活為神經(jīng)修復提供適宜的微環(huán)境，從而促進近端神經(jīng)纖維末端再生。 


圖6. （A-B）SCs驗證：S100和MBP；（C-D）外泌體干預24h后EdU和H3P的表達；（E）外泌體抑制SCs凋亡情況；（F-H）基因表達情況。


5.HG@Exo改善大鼠CN/MPG的結(jié)構(gòu)和功能


  手術(shù)治療4周后，發(fā)現(xiàn)HG@Exo組陰莖海綿體平滑肌組織明顯增厚、平滑肌與膠原蛋白的比例也顯著提高（圖7）。分析大鼠nNOS陽性神經(jīng)纖維含量，可知HG@Exo組大鼠的陰莖背神經(jīng)中nNOS陽性神經(jīng)纖維顯著高于BCNI組（圖8A-B），蛋白表達也顯著升高（圖8C-D），表明HG@Exo顯著改善了BCNI大鼠的海綿組織結(jié)構(gòu)和竇內(nèi)皮功能。
此外，相比假手術(shù)組，BCNI組CN/MPG顯示出軸突腫脹、軸突空泡化和低密度神經(jīng)絲，而HG@Exo組大鼠神經(jīng)絲染色的密度和規(guī)律性得到顯著改善（圖9），表明HG@Exo顯著提高了CN/MPG的結(jié)構(gòu)和功能。 


圖7.（A）Masson染色；（B）平滑肌含量和膠原蛋白含量比值。 



圖8.（A）背神經(jīng)束nNOS表達；（B）nNOS半定量分析；（C）大鼠海綿體中nNOS表達；（D）nNOS與β-肌動蛋白比值。 


圖9.（A）神經(jīng)束半定量分析；（B）神經(jīng)絲平均密度；（C）CN/MPG的Masson染色；（D）膠原蛋白含量。

  以上工作以“Injectable thermo-sensitive hydrogel containing ADSC-derived exosomes for the treatment of cavernous nerve injury”為題發(fā)表在《Carbohydrate Polymers》期刊上（中科院大類一區(qū)，IF：10.723）。本文第一作者為山東省立醫(yī)院副主任醫(yī)師劉帥和山東大學碩士研究生李瑞宇，通訊作者為青島大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院周祺惠特聘教授（課題組網(wǎng)站：https://www.x-mol.com/groups/BMTMers, 課題組微信公眾號：生物材料與轉(zhuǎn)化醫(yī)學課題組）和山東省立醫(yī)院泌尿外科傅強教授。


  該工作得到國家自然科學基金（No. 81602227，81873830，82071653），天津市玻尿酸應用研究企業(yè)重點實驗室開放基金（No. KTRDHA-Y201902），山東省醫(yī)藥衛(wèi)生發(fā)展計劃（No. 202004051394），濟南市科技計劃（No. 201907037，202134010），國家衛(wèi)生健康委員會醫(yī)藥衛(wèi)生發(fā)展計劃（No. HDSL2020010640），山東省中醫(yī)藥科技項目（No. M-2022209）和濟南市新建高校20項目（No. 2021GXRC085）等資助。


  原文鏈接:https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2022.120226

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（責任編輯：xu）
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