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  細(xì)菌納米纖維素（Bacterial nanocellulose，BNC）管在小口徑人工血管領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力，然而水凝膠態(tài)下，力學(xué)性能弱、縫合強(qiáng)力較低和順應(yīng)性不足等問(wèn)題，也一定程度上限制了BNC管的應(yīng)用。雖然目前可以通過(guò)濃堿處理來(lái)制備絲光化BNC（Mercerized BNC，MBNC）以提升BNC管的力學(xué)性能，但是其縫合強(qiáng)力仍然較低，彈性較差，這使得BNC及MBNC管的手術(shù)操作變得相對(duì)困難。因此，東華大學(xué)洪楓教授團(tuán)隊(duì)結(jié)合了濃堿處理技術(shù)和水溶性彈性高分子材料聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）的冷凍相分離技術(shù)，制備了具有彈性的絲光化BNC/PVA復(fù)合小口徑人工血管（MBP），評(píng)估了其應(yīng)用潛力。該成果以Production of novel elastic bacterial nanocellulose/polyvinyl alcohol conduits via mercerization and phase separation for small-caliber vascular grafts application為題，發(fā)表于International Journal of Biological Macromolecules上。

聚乙烯醇的引入——絲光化BNC/PVA復(fù)合管結(jié)構(gòu)與物理性能的變化

圖2 BNC、MBNC和MBP管的微觀形貌（FE-SEM）：（A）內(nèi)表面；（B）外表面。

  由于PVA會(huì)在堿溶液中發(fā)生沉淀，因此PVA在BNC網(wǎng)絡(luò)中的沉積在一定程度上抑制了絲光化過(guò)程中BNC的體積收縮。所以，與MBNC相比，MBP管的體積收縮率更低（見(jiàn)圖3B）。樣品的持水量如圖3C所示，BNC的持水量為197.66 mL/g，遠(yuǎn)高于MBNC和MBP管，由于絲光處理和PVA的引入，MBNC和MBP管持水能力下降。

  與BNC相比，MBP管的軸向楊氏模量、徑向拉伸強(qiáng)度和爆破壓力隨著PVA含量的增加而提高，但其數(shù)值仍低于MBNC管（見(jiàn)圖3D、圖3E和圖3H）。此外，圖3F為BNC、MBNC和MBP管的應(yīng)力應(yīng)變曲線，PVA的引入改變了其力學(xué)拉伸特性，并且MBP管也具有遠(yuǎn)高于BNC和MBNC的縫合強(qiáng)力，并隨著PVA含量的增加而提高（圖3G），變得利于手術(shù)操作。

圖3 BNC、MBNC和MBP管的物理化學(xué)性質(zhì)：（A）傅里葉全反射紅外光譜；（B）體積收縮率；（C）持水量；（D）軸向楊氏模量；（E）徑向拉伸強(qiáng)度；（F）應(yīng)力-應(yīng)變曲線；（G）縫合強(qiáng)力；（H）爆破壓；（I）表面孔隙率。*代表0.01<p<0.05，**代表p<0.01，#代表無(wú)顯著性差異p>0.05

圖4 MBP管的循環(huán)蠕變-恢復(fù)試驗(yàn)：（A）力-應(yīng)變曲線和（B）應(yīng)變-時(shí)間曲線；（C）MBP管的循環(huán)應(yīng)力保持試驗(yàn)（黑線：力-時(shí)間曲線；紅線：應(yīng)變-時(shí)間曲線）。

體外生物相容性的評(píng)估

  圖5A為BNC、MBNC和MBP管的BSA蛋白吸附量結(jié)果。BNC的蛋白吸附量最高，為59.53 μg/cm²，MBNC、MBP-10、MBP-12.5和MBP-15上的BSA吸附量分別為5.30 μg/cm²、21.68 μg/cm²、14.56 μg/cm²和5.31 μg/cm²，均顯著低于BNC的蛋白吸附量。根據(jù)ISO 10993-4:2002，血液接觸類醫(yī)療器械的溶血率應(yīng)低于5%。圖5B的溶血率結(jié)果顯示BNC、MBNC和MBP管的溶血率均低于0.25%，說(shuō)明其不會(huì)造成溶血，符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 BNC、MBNC和MBP管的血液相容性：（A）蛋白吸附量；（B）溶血率；（C）血漿復(fù)鈣動(dòng)力曲線；（D）全血凝固時(shí)間。（PVA膜作為對(duì)照）**代表p<0.01

  全血凝固實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖5D所示，在全血凝固實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)PVA膜的OD值高于于BNC、MBNC和MBP管，其原因可能在于BNC基人工血管表面的纖維和多孔結(jié)構(gòu)可能可以吸附更多的蛋白質(zhì)。此外，需要特別注意的是，在與血液接觸35分鐘內(nèi)，MBNC和MBP管在OD₅₄₀的吸光度均高于BNC，表明在與血液接觸的一段時(shí)間內(nèi)MBNC和MBP管上的血液比BNC管凝固得更慢。

圖6 BNC、MBNC和MBP管內(nèi)表面的血小板粘附量（PVA膜作為對(duì)照）

  根據(jù)ISO 10993-12:2021的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，采用共培養(yǎng)法所測(cè)定HUVECs細(xì)胞存活率來(lái)測(cè)定BNC、MBNC和MBP管材的細(xì)胞毒性。圖7A為共培養(yǎng)法所得HUVECs的細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率均高于80%，無(wú)明顯細(xì)胞毒性。

圖7 BNC、MBNC和MBP管的細(xì)胞相容性：（A）共培養(yǎng)法所得HUVECs的細(xì)胞存活率；（B）HUVEC的在樣品內(nèi)表面的增殖情況。*代表0.01<p<0.05，**代表p<0.01，#代表無(wú)顯著性差異p>0.05

MBP管的體內(nèi)功效評(píng)估——SD大鼠腹主動(dòng)脈移植實(shí)驗(yàn)

  用MBP-12.5小徑管替換SD大鼠的部分腹主動(dòng)脈以詳細(xì)評(píng)估其體內(nèi)生物相容性。圖8A為SD大鼠腹主動(dòng)脈移植實(shí)驗(yàn)的示意圖以及多普勒超聲圖像結(jié)果。其結(jié)果顯示，在植入1周、4周、8周、12周、16周、20周和32周這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，MBP-12.5管腔內(nèi)可以觀察到正常的血流信號(hào)，血流正常，表明MBP-12.5在腹主動(dòng)脈移植后保持了相對(duì)滿意的遠(yuǎn)期通暢率。

  在MBP-12.5替換腹主動(dòng)脈32周后，以SD大鼠的自體血管為對(duì)照，用組織學(xué)染色和免疫熒光染色研究MBP-12.5上的組織形成情況。圖8B為MBP-12.5替換腹主動(dòng)脈32周的組織學(xué)染色和免疫熒光染色結(jié)果，其中自體血管的橫截面被稱為Control，MBP-12.5管中段的橫截面被稱為Cross section，MBP-12.5管的軸向橫截面被稱為Axial section，MBP管與自體血管吻合處的橫截面被稱為Anastomosis，以研究植入的效果（圖8B）。圖8B中的紅色熒光（CD31）為內(nèi)皮細(xì)胞，綠色熒光（α-SMA）為平滑肌細(xì)胞，藍(lán)色熒光（DAPI）為細(xì)胞核。在樣品中段橫截面（Cross section）、血管吻合處橫截面（Anastomosis）和樣品軸向橫截面（Axial section）中均可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞的紅色熒光、平滑肌細(xì)胞的綠色熒光及細(xì)胞核的藍(lán)色熒光，表明MBP-12.5管腔的內(nèi)部形成了內(nèi)皮層，并且在內(nèi)皮層的下方有平滑肌細(xì)胞生成。Control中CD31的熒光比其他樣本中的熒光更亮、更清晰，這意味著MBP-12.5的管腔內(nèi)部雖然有內(nèi)皮層的再生，但是內(nèi)皮層的再生效果可能并沒(méi)有自體血管好。此外，組織學(xué)染色結(jié)果（H&E以及Masson）也與免疫熒光的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

圖8 （A）MBP-12.5的植入示意圖以及其植入后1-32周的多普勒彩超；（B）MBP-12.5植入32周的免疫熒光染色結(jié)果、H＆E染色結(jié)果和Masson染色結(jié)果（每組黃色和紅色虛框內(nèi)的放大結(jié)果均在其下方顯示）

  全文下載鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.124221