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  東華大學(xué)洪楓教授團隊將大腸桿菌E. coli K-12的甘露糖激酶和磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因引入木葡糖酸醋桿菌（Komagataeibacter xylinus, K. xylinus）ATCC 23770中，構(gòu)建了強化甘露糖代謝能力的K. xylinus重組菌，并探究了外源基因引入后對菌株發(fā)酵過程和細菌纖維素（bacterial cellulose, BC）產(chǎn)品理化性質(zhì)的影響。相較于原始菌，重組菌能夠更有效地利用甘露糖碳源，該技術(shù)為今后充分利用咖啡渣、魔芋以及云杉木屑等富含甘露糖/甘露聚糖的生物質(zhì)資源生產(chǎn)BC開辟了新途徑。該成果以A recombinant strain of Komagataeibacter xylinus ATCC 23770 for production of bacterial cellulose from mannose-rich resources為題，發(fā)表在歐洲生物技術(shù)聯(lián)合會The European Federation of Biotechnology的官方期刊New Biotechnology（DOI: 10.1016/j.nbt.2023.05.002）。

  細菌纖維素（BC）以其高的純度、聚合度、結(jié)晶度和比表面積，以及良好的生物相容性等優(yōu)越性能而聞名。基于這些優(yōu)點，BC在食品、紡織造紙、廢水處理、聲學(xué)和功能材料、生物材料、醫(yī)療器械等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。然而目前，BC產(chǎn)量和產(chǎn)率低，生產(chǎn)成本高昂，且傳統(tǒng)培養(yǎng)基椰子水資源日漸匱乏，因此以其它廉價天然生物質(zhì)資源為原料生產(chǎn)BC是一必由之路。目前工業(yè)界遇到的瓶頸之一是主要生產(chǎn)菌——木葡糖酸醋桿菌K. xylinus對天然生物質(zhì)培養(yǎng)基中全組分利用的效率低下，因此尚未真正實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

  影響B(tài)C生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素之一是發(fā)酵工藝。發(fā)酵工藝的優(yōu)化以細菌培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，涉及工藝的改進、添加劑的使用和廉價培養(yǎng)基的開發(fā)。與其他方式相比，廉價培養(yǎng)基可以顯著降低成本。據(jù)報道，該課題組前期開發(fā)了利用工農(nóng)業(yè)低值產(chǎn)品以及木質(zhì)纖維素廢棄物為培養(yǎng)基原料，譬如魔芋粉（Carbohydrate Polymers，2008，DOI: 10.1016/j.carbpol.2007.09.015）、紙漿工業(yè)的云杉木屑/碎片（Microbial Cell Factories，2013，DOI: 10.1186/1475-2859-12-93）、棉紡織品廢料（Journal of Chemical Technology & Biotechnology，2016，DOI:10.1002/jctb.4738），已被證明具有作為培養(yǎng)基的潛力。由于生物質(zhì)培養(yǎng)基所含營養(yǎng)物的復(fù)雜性，BC生產(chǎn)菌對多種碳源的代謝能力有限，勢必造成資源浪費甚至環(huán)境污染。

  木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。以干重計，15-25%的木質(zhì)纖維素為半纖維素。具體來說，甘露聚糖是針葉木材、豆類和一些工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品（廢棄咖啡渣、棕櫚仁壓餅等）中最豐富的半纖維素。K. xylinus代謝甘露糖關(guān)鍵的限制步驟為磷酸化和異構(gòu)化，甘露糖被轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖進入代謝通路（圖1）。

圖1 重組K. xylinus甘露糖代謝圖

  針對上述問題，東華大學(xué)洪楓教授課題組以生物質(zhì)資源中豐富的甘露糖為目標(biāo)，在K. xylinus中強化其代謝途徑來更充分地利用復(fù)雜的生物質(zhì)資源，并評估了重組菌用于BC生產(chǎn)的可行性。

圖2 重組質(zhì)粒pBBR1MCS2::pmi::mak

  該研究結(jié)果表明，在K. xylinus ATCC 23770中引入外源基因mak和pmi（圖2）構(gòu)建重組菌后，甘露糖的代謝效率顯著提高。比較原始株和重組菌株，最明顯的差異是重組菌的甘露糖利用率提高了1.6倍，BC產(chǎn)量提高了84%（圖3）。在甘露糖培養(yǎng)基中，重組菌株BC的平均纖維直徑28.1 nm高于原始菌株的22.7 nm（圖4）；原始菌株和重組菌株所產(chǎn)BC的FTIR光譜無明顯差異（圖5）；重組菌株BC在葡萄糖培養(yǎng)基中的結(jié)晶度為61.1%，略低于在甘露糖培養(yǎng)基中的結(jié)晶度63.1%（圖6）；此外，重組菌株在甘露糖培養(yǎng)基中合成的BC的力學(xué)性能也得到了顯著改善。拉伸強度和伸長率提高1.7倍，楊氏模量提高1.3倍（圖7）。結(jié)果表明，mak和pmi的表達使重組菌株對甘露糖具有更好的適應(yīng)性，生產(chǎn)的BC具有更好的力學(xué)性能。

  綜上所述，該研究獲得了一株具有高效利用甘露糖能力的重組菌株。與原始株相比，甘露糖培養(yǎng)基獲得的BC產(chǎn)量和性能都有了顯著提高。因此，以廉價的富含甘露糖/甘露聚糖的生物質(zhì)為原料，開發(fā)對應(yīng)的超強工程菌株是可行的，這一策略對提高BC的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本具有重要意義。該項目是全球首個針對BC生產(chǎn)菌——木葡糖酸醋桿菌拓寬碳源譜的合成生物學(xué)研究，具有里程碑意義。

圖3原始菌株和重組菌株的pH (A)、溶解氧(B)、殘?zhí)?C)、游離細胞數(shù)(D)和BC產(chǎn)量(E)

圖4 原始菌株和重組菌株生產(chǎn)BC的掃描電鏡和纖維直徑

圖5原始菌株和重組菌株生產(chǎn)BC傅里葉變換紅外光譜

圖6 原始菌株和重組菌株生產(chǎn)BC的聚合度(左)和XRD測試曲線(右)

 圖7 原始菌株和重組菌株生產(chǎn)BC的力學(xué)性能

  論文第一作者為東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士研究生楊帆，通訊作者為纖維材料改性國家重點實驗室（東華大學(xué)）和細菌納米纖維制造及復(fù)合技術(shù)科研基地的洪楓教授。該研究得到了山東省科學(xué)院齊魯工業(yè)大學(xué)生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室開放基金（KF201920）和海南省重點研發(fā)計劃項目（ZDYF2021GXJS025）等資助。

  全文下載鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678423000225