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  構(gòu)建體外模擬活組織和器官的模型具有巨大的潛力。這些模型可能會為創(chuàng)造用于組織再生的植入式生物材料帶來突破并為有效的藥物和毒性篩查提供平臺。挑戰(zhàn)在于開發(fā)能夠模擬生理或病理條件復雜性的技術(shù)，包括活細胞、細胞外基質(zhì)和專門的生物材料。自上而下的生物制造技術(shù)可以將細胞和生物材料操縱成預先確定的、空間排列的結(jié)構(gòu)，從而制造出厘米大小的模型。這些模型能夠捕捉組織和器官的基本結(jié)構(gòu)細微差別和功能。在自上而下的方法中，無論是基于擠出的，還是基于光照的 3D 生物打印都很普遍�；跀D出的方法將充滿細胞的“生物墨水”沉積在分層圖案中以形成 3D 結(jié)構(gòu)。這些方法適用于廣泛的生物材料，但它們面臨著低分辨率（≈200微米）和結(jié)構(gòu)簡單等局限性。尤其是在創(chuàng)建具有管腔的復雜自由曲面結(jié)構(gòu)時，這種方法面臨著挑戰(zhàn)。

  2024年4月8日，來自深圳大學微流控與軟物質(zhì)課題組在《Advanced Functional Materials》雜志發(fā)表題為“Multi-Material Digital Light Processing (DLP) Bioprinting of Heterogeneous Hydrogel Constructs with Perfusable Networks”的研究論文，提出了利用生物墨水PEGDA-AAm和多材料DLP生物打印來開發(fā)多組分、多模量、充滿細胞的水凝膠構(gòu)建體。這些結(jié)構(gòu)具有異質(zhì)的機械性能、復雜的結(jié)構(gòu)和精確設(shè)計的表面微觀結(jié)構(gòu)。

1.使用多材料DLP打印并將AAm和PEGDA分別作為水凝膠的軟硬結(jié)構(gòu)組分混合來制備水凝膠前體。

圖1 用作體外模型的水凝膠構(gòu)建體的示意圖

2.PEGDA-AAm生物墨水的性能表征

  生物墨水的凝膠化時間（T_gel）顯著影響其可打印性。對25、35和50wt%濃度的PA生物墨水進行照射交聯(lián)10秒。結(jié)果顯示，低濃度的PA生物墨水僅部分凝膠化，當瓶子倒置時未固化的墨水沿瓶壁流下。相反，50wt%濃度的PA生物墨水顯示完全凝膠和固化，幾乎沒有墨水流動。這表明50wt%的PA生物墨水更適合創(chuàng)建復雜的結(jié)構(gòu)（圖2A）。

  為了定量確定PEGDA-AAm（PA）生物墨水的凝膠化時間（T_gel），對其光流變性能進行了表征。當儲存模量（G''）與損耗模量（G''''）相匹配時，確定了T_gel。將PA生物墨水的單體濃度提高會導致T_gel降至2.75秒（圖2B），這比通常需要幾十秒的GelMA的凝膠化時間要快得多。

  在DLP 3D生物打印中，優(yōu)化打印分辨率涉及調(diào)節(jié)未固化墨水的粘度和固化后水凝膠的剛度。這對確保固化結(jié)構(gòu)與殘留液體墨水之間的清晰分離至關(guān)重要。這些屬性的相互作用通過固化后水凝膠的G''和未固化墨水的G''''來定量捕捉。打印分辨率的有效性由這些模量的差異（ΔG）決定。比較不同單體濃度的PA生物墨水的ΔG，發(fā)現(xiàn)50%單體濃度的PA生物墨水的ΔG要高一個數(shù)量級（圖2C）。鑒于其較短的T_gel和較高的ΔG，50%單體濃度的PA生物墨水更有希望增強可打印性，成為了后續(xù)實驗的首選。

  為了優(yōu)化曝光參數(shù)，研究者們探索了曝光參數(shù)對XY平面和Z方向的打印分辨率的影響。研究者發(fā)現(xiàn)，使用較高的光能來打印100 μm寬的凹槽會導致過固化。相比之下，較低的光能使得相同寬度的凹槽的打印精度提高到了約90%（圖2D）。在較高的光能水平下，精度降低的原因是因為在沒有光吸收劑的情況下，生物墨水中的光散射增加，導致凹槽變窄。對于30 μm寬的凹槽，在較高和較低的光能下的打印精度分別為53%和60%。在創(chuàng)建細微的平面結(jié)構(gòu)時，可通過調(diào)整光強度和曝光時間從而精確控制所得到的打印寬度。

  向生物墨水中添加光吸收劑可以有效提高打印精度。光吸收劑均勻混合到墨水中后可降低不同區(qū)域的光能。它們吸收大部分散射光，顯著減少了不必要的固化，從而提高了打印精度。然而，雖然較高濃度的光吸收劑可以增加精度，但也可能導致固化層變薄，影響打印效率。研究者發(fā)現(xiàn)，將1%的光吸收劑添加到PA生物墨水中可以實現(xiàn)最佳平衡，既確保了高打印精度，又保持了效率（圖2E,F）。

  在PA生物墨水中，研究者成功地將得到的PEGDA-AAm水凝膠的彈性模量調(diào)整在數(shù)十到數(shù)百kPa的范圍內(nèi)。僅通過控制單體濃度和PEGDA:AAm（PA）比例來實現(xiàn)這一點。具有2%、5%和10%比例的特定PA墨水被分別命名為PA1、PA2和PA3。這些水凝膠的彈性模量在45至210 kPa之間，應變范圍從90%到350%不等（如圖2G,H所示）。PA水凝膠在水環(huán)境中表現(xiàn)出了良好的結(jié)構(gòu)完整性和尺寸穩(wěn)定性，使其成為體外模型建設(shè)中的理想支架材料。例如，PA1水凝膠在浸泡在水中7天后的重量幾乎保持不變，這意味著PA1水凝膠沒有水解（圖2I）。這種穩(wěn)定性是由于PA水凝膠與雙網(wǎng)絡(luò)的強化學交聯(lián)，確保了水凝膠的結(jié)構(gòu)在較長時間內(nèi)保持完整，即使在PBS溶液中也是如此。鑒于這些性質(zhì)，PA水凝膠可以用于構(gòu)建各種組織的模型。

3.使用PA生物墨水構(gòu)建單組分體外組織模型

  為展示DLP生物打印在制備具有可灌注網(wǎng)絡(luò)的細胞載體水凝膠結(jié)構(gòu)方面的潛力，研究者創(chuàng)建了微流控芯片，其中包含直通和氣管狀通道。為驗證結(jié)構(gòu)內(nèi)部成功打印了空腔通道，將顯示藍色熒光的NIH-3T3細胞注入到這些通道中（圖3A）。研究者展示了兩種不同水凝膠構(gòu)建物的成功制備，其中包含嵌入的空心結(jié)構(gòu)（圖3B，E）�；旌系缴锬械�Hela-GFP細胞在整個水凝膠中均勻分布，而注入的NIH-3T3細胞充滿了空心通道，它們的藍色熒光清晰地勾勒出這些嵌入式微通道。綠色熒光的Hela-GFP細胞與藍色熒光的NIH-3T3細胞之間的清晰區(qū)別（圖3C，D，F，G），每個細胞都限定在特定區(qū)域。這些結(jié)果表明，在DLP打印中使用的PA生物墨水非常有效，可以制造具有精確灌注通道的模型，確保水凝膠構(gòu)建物中特定細胞的均勻分布。

圖3 充滿細胞的PA水凝膠構(gòu)建體具有可灌注網(wǎng)絡(luò)和工程表面形貌。

4.使用PA生物墨水構(gòu)建單組分體外組織模型

  在組織工程中，復制肝小葉、皮膚和軟骨等組織和器官固有的多樣化機械模量是一個挑戰(zhàn)。研究者利用多材料DLP技術(shù)和多功能PA生物墨水將具有不同機械特性的組件可靠地組裝成單一的體外模型。例如，PA1和PA2水凝膠通過在它們的界面處固化未固化的PA生物墨水來實現(xiàn)它們之間的粘接（圖4A）。結(jié)果表明，將兩種尺寸相同但配方不同的水凝膠組合在一起，得到了具有適度且平衡的機械特性的水凝膠（圖4B）。此后，在同一平面上打印PA1和PA3生物墨水的預設(shè)計圖案，并允許它們相互連接（圖4C）。總的來說，這種異質(zhì)結(jié)構(gòu)的整體機械性能取決于不同機械特性的不同組分如何配置和連接在一起。良好設(shè)計的結(jié)構(gòu)布局可以確保應力均勻分布或指向更堅硬的區(qū)域，增強結(jié)構(gòu)完整性和機械穩(wěn)健性。

  為了展示多材料DLP在制造與生物相關(guān)的異質(zhì)組織模型方面的能力，研究者開發(fā)了一個簡化的肝小葉模型（圖4D），其中藍色PA3和紅色PA1生物墨水分別代表肝竇和肝板。由于NIH-3T3和Hela-GFP細胞在生物材料中的廣泛應用，研究者選擇了這兩種細胞作為代表性例子。這些細胞類型被合并到了PA1和PA3生物墨水中，形成了一個平面的異質(zhì)生物結(jié)構(gòu)。這種成功創(chuàng)建的多組分模型展示了該方法在研究水凝膠材料中的細胞相互作用方面的潛力。這些材料在細胞類型和機械特性上都有差異，滿足了不同組織模量的需求。

  為了將對異質(zhì)性的探索擴展到XY平面之外，并展示沿Z軸構(gòu)建異質(zhì)結(jié)構(gòu)的可行性，研究者還設(shè)計了一個涉及具有TPMS拓撲結(jié)構(gòu)的管狀結(jié)構(gòu)的實驗。這個結(jié)構(gòu)被分成了三個不同的部分，每個部分都使用具有不同模量的PA1、PA2和PA3生物墨水制作（圖4G）。對這個集成樣品進行的應力加載測試證實了不同組分在具有TPMS特征的中空管中的有效融合，展示了沿Z軸方向的異質(zhì)模量。這種成功的集成展示了該方法在以3D方式創(chuàng)建復雜的多模量結(jié)構(gòu)方面的潛力。

  作為概念驗證，研究者利用多組分、多模量水凝膠結(jié)構(gòu)并配有表面微結(jié)構(gòu)來研究細胞行為。眾所周知，腫瘤細胞的粘附、增殖、遷移和侵襲行為與材料基質(zhì)的特性密切相關(guān)。為了研究腫瘤細胞的優(yōu)先遷移和生長，將Hela-GFP細胞引入到多組分TPMS結(jié)構(gòu)中。PA1水凝膠上的Hela-GFP細胞在擴展方面比PA2和PA3部分上的細胞更加廣泛，顯示出與侵襲性侵襲行為相關(guān)的開放式、紡錘形態(tài)。相反，PA2、PA3水凝膠上的Hela-GFP細胞傾向于在凹陷區(qū)域內(nèi)聚集，主要呈現(xiàn)圓形，幾乎沒有擴散跡象（圖4J）。因此，模量約為40 kPa的水凝膠結(jié)構(gòu)有利于宮頸癌腫瘤細胞的遷移和侵襲，而模量較高的水凝膠鼓勵細胞聚集。本研究開發(fā)的模量差異化的異質(zhì)結(jié)構(gòu)提供了一種多功能方法，用于研究基質(zhì)模量對各種細胞行為的影響。此外，這些結(jié)構(gòu)還有望用于共培養(yǎng)系統(tǒng)，以研究異質(zhì)細胞群體之間的相互作用，這對于增強工程組織的性能至關(guān)重要。

圖4 充滿細胞的多材料異質(zhì)水凝膠構(gòu)建體。

  原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202316456