腦出血手術(shù)后的術(shù)后再出血與高死亡率密切相關(guān)，但目前尚無有效的臨床治療方法。在本研究中，他們開發(fā)了一種血紅蛋白（Hb）響應(yīng)性的原位植入式DNA水凝膠，該水凝膠包含與兩條互補(bǔ)鏈交聯(lián)的Hb適體，并封裝了甲磺酸去鐵胺（DFO）。功能性地，該水凝膠在術(shù)后再出血時通過捕獲Hb產(chǎn)生信號，展現(xiàn)出獨(dú)特的“自我診斷”能力。此外，持續(xù)捕獲Hb會介導(dǎo)水凝膠的逐漸解體，從而實(shí)現(xiàn)DFO的按需釋放，而不會影響生理鐵依賴功能。這一過程通過抑制神經(jīng)細(xì)胞的鐵死亡來實(shí)現(xiàn)自我治療。在膠原酶和自體血液注射模型誘導(dǎo)的模擬術(shù)后再出血模型中，該水凝膠展示了鐵吸收效率的5.58倍提升，顯著減少了血腫大。◤8.674立方毫米減少到4.768立方毫米）。這種創(chuàng)新的Hb響應(yīng)性DNA水凝膠不僅為術(shù)后再出血提供了治療干預(yù)，而且還提供了自我診斷反饋，為提高臨床治療效果帶來了顯著的希望。
腦出血（ICH） 是一種危重疾病，其特征是血液突然自發(fā)滲入腦實(shí)質(zhì)。它是第二常見的中風(fēng)亞型，因其極高的死亡率和發(fā)病率而引起極大關(guān)注。手術(shù)干預(yù)具有預(yù)防腦疝和減輕血腫對周圍組織的病理生理影響的潛力。然而，由手術(shù)引起的術(shù)后再出血風(fēng)險仍然普遍。此外，盡管具有減少占位效應(yīng)、改善顱內(nèi)壓和增強(qiáng)腦灌注的好處，但手術(shù)的浸潤性往往會留下殘留產(chǎn)物，影響患者的預(yù)后，并可能導(dǎo)致嚴(yán)重病例的再出血。再出血的發(fā)生可能不容易被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致錯失挽救機(jī)會和隨之而來的致命結(jié)果。
在此，他們設(shè)計(jì)了一種血紅蛋白（Hb）響應(yīng)性原位植入式DNA水凝膠的構(gòu)建和特性。這種水凝膠由Hb適體與兩條互補(bǔ)鏈交聯(lián)而成，并封裝了甲磺酸去鐵胺（DFO）。其設(shè)計(jì)原理是，在術(shù)后再出血的情況下，水凝膠能夠通過捕獲Hb發(fā)出信號，實(shí)現(xiàn)自我診斷。同時，Hb的持續(xù)捕獲會觸發(fā)水凝膠的逐步解體，從而按需釋放DFO，這一過程不會干擾鐵依賴性的生理功能，并通過抑制神經(jīng)細(xì)胞的鐵死亡達(dá)到自我治療的目的。
圖1.原位植入式DNA水凝膠用于腦出血術(shù)后再出血的診斷與治療
2. DNA 水凝膠的合成
為篩選與 Hb 特異性結(jié)合的最優(yōu)核酸鏈，首先，通過磁珠實(shí)驗(yàn)證明當(dāng) DNA B 鏈與適配體 7 個堿基配對時 Hb 的特異性最強(qiáng)并以 7 個堿基互補(bǔ)作為后續(xù)的核酸鏈。通過瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)證明丙烯酰胺基團(tuán)修飾的 DNA-A（Strands-A, S-A） 和丙烯酰胺修飾的 DNA-B（Strands-B, S-B）成功連接到聚丙烯酰胺上。后續(xù)在合成的聚合物 A 鏈（Polymer strands A, PS-A）和聚合物 B 鏈（Polymer strands B, PS-B）混合溶液中加入 Hb適配體后，PS-A和 PS-B的混合溶液流動性明顯降低，證明 DNA 水凝膠成功合成。
圖2.DNA水凝膠的合成
3. DNA 水凝膠的特性
為了篩選有較好注射性能且與腦部模量相匹配的 DNA 水凝膠，分別制備了 0.3、0.7 和 1 mM Hb 適配體濃度交聯(lián)的 DNA 水凝膠？疾炝巳N DNA 水凝膠的可注射性、流變性、膨脹率、溶膠率以及藥物包封率。結(jié)果證明 0.7 mM 交聯(lián)的 DNA 水凝膠具備可注射性且儲存模量與大腦模量相匹配（200 Pa）。通過測定三種 DNA 水凝膠溶膠率以及藥物包封率，結(jié)果證明 0.7 mM DNA 水凝膠的溶膠率可以達(dá)到 60%并且 0.7 mM 的包封率與 1 mM 的包封率相接近可達(dá)到 87%。綜上，0.7 mM Hb 適配體交聯(lián)的 DNA 水凝膠具有合適的機(jī)械性和特異性，采用 0.7 mM 交聯(lián)濃度作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件。
圖3. DNA水凝膠的特性
4. DNA 水凝膠響應(yīng)性藥物釋放的研究
基于上述所篩選出的合適的 DNA 水凝膠，考察了該 DNA 水凝膠體外的特異響應(yīng)性。首先采用掃描電鏡（Scanning electron microscope, SEM）和流變儀測定了在加入 Hb 后 DNA 水凝膠孔徑和模量變化，實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)加入 Hb 后 DNA 水凝膠孔徑變大，儲存模量降低至 16 Pa 左右。其次也考察了 DNA 水凝膠的特異性、選擇性和靈敏性。以突變適配體交聯(lián)的未響應(yīng) DNA 水凝膠（No-responsive gel, No-res. gel）為對照，驗(yàn)證響應(yīng) DNA 水凝膠可以實(shí)現(xiàn)特異性溶膠，以牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）為對照，證明 DNA 水凝膠僅對 Hb 有特異選擇性。最后考察了不同濃度 Hb 的溶膠率，DNA 水凝膠對 Hb 有明顯的濃度依賴和時間依賴性。同時，驗(yàn)證了 DNA 水凝膠藥物釋放率，結(jié)果表明在 120 min時達(dá)到藥物釋放飽和且呈現(xiàn) Hb 濃度依賴，藥物釋放率可達(dá)到 85%。為了進(jìn)一步考察藥物釋放的可控性，將 Hb 溶液間歇性地注入 DNA 水凝膠中，結(jié)果表明加入 Hb 后藥物釋放率增加而取出 Hb 后藥物釋放率顯著降低。
圖4.體外Hb響應(yīng)性藥物按需釋放的DNA水凝膠
5. DNA 水凝膠神經(jīng)細(xì)胞體外保護(hù)的研究
通過 Trans-well 建立鐵超載模型，通過測定經(jīng) DNA 水凝膠處理后細(xì)胞內(nèi)鐵的含量、谷胱甘肽過氧化物酶 4（Glutathione peroxidase 4, GPX4）的表達(dá)以及脂質(zhì)氧化情況。FerroOrange 染色和流式結(jié)果證明 DNA 水凝膠降低了細(xì)胞內(nèi)過量的鐵，蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting, WB）實(shí)驗(yàn)證明了 DNA 水凝膠可以逆轉(zhuǎn)鐵死亡通路中 GPX4 的下調(diào)，此外活性氧（Reactive oxygen species, ROS）和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）實(shí)驗(yàn)證明 DNA 水凝膠可以明顯降低脂質(zhì)氧化水平，表明 DNA 水凝膠可以抑制鐵死亡。最后，考察 DNA 水凝膠可以實(shí)現(xiàn)對 DFO 的按需釋放而不破壞正常細(xì)胞內(nèi)鐵濃度，通過測定神經(jīng)細(xì)胞活力證明經(jīng) DNA 水凝膠有明顯的神經(jīng)保護(hù)效果。
圖5. 體外通過對抗鐵死亡和Hb毒性的DNA水凝膠的保護(hù)效果
6. DNA 水凝膠的體內(nèi)生物安全性評價
為了考察水凝膠在體內(nèi)的生物相容性，以正常小鼠和膠原酶誘導(dǎo)的 ICH 模型為研究對象，考察了 DNA 水凝膠在體內(nèi)的穩(wěn)定性和特異性，結(jié)果證明了 DNA 水凝膠和未響應(yīng) DNA 水凝膠在正常的小鼠體內(nèi)可保持 7 天穩(wěn)定。在 ICH 模型，觀察到 DNA 水凝膠在第 2 天逐步溶膠，在第 6 天基本完全溶解，而未響應(yīng) DNA 水凝膠在一周內(nèi)基本穩(wěn)定，表明 DNA 水凝膠在 ICH 可以發(fā)生特異性溶膠。此外，以生理鹽水為對照，將 DNA 水凝膠注入正常小鼠內(nèi)，通過酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assays， ELISA）考察了小鼠腦部炎癥因子的變化，結(jié)果表明，DNA 水凝膠并沒有引起明顯的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步通過蘇木素-伊紅染色（Hematoxylin and eosin stain，H&E） 和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記染色（Transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL），證明了 DNA 水凝膠在小鼠體內(nèi)具有良好的生物相容性。
圖6. 體內(nèi)水凝膠的穩(wěn)定性、特異性和生物安全性
7.DNA 水凝膠的體內(nèi)藥效學(xué)評價
進(jìn)一步考察了 DNA 水凝膠的體內(nèi)治療效果，首先以膠原酶誘導(dǎo)的 ICH 模型為基礎(chǔ)，通過普魯士藍(lán)染色和 GPX4 的 免疫熒光染色證明了小鼠腦部的鐵沉積明顯降低且 DNA水凝膠逆轉(zhuǎn)了再出血后 GPX4 的下調(diào)，后續(xù)通過 ROS 免疫熒光染色和 MDA 實(shí)驗(yàn)，證明了 DNA 水凝膠 顯著降低了小鼠腦部的脂質(zhì)氧化水平。此外，血腫的吸收與鐵死亡有密切的關(guān)系，經(jīng)DNA 水凝膠治療后小鼠腦部血腫從 17%降至 4%，隨后測定了小鼠腦部 Hb 的含量，結(jié)果證明趨勢同血腫一樣，Hb 濃度也明顯降低。術(shù)后行為學(xué)恢復(fù)對治療干預(yù)的有效性至關(guān)重要，通過考察 DNA 水凝膠治療后第 1 天、第 2 天、第 3 天 和第 7 天的行為學(xué)恢復(fù)，結(jié)果也證明了 DNA 水凝膠組在術(shù)后恢復(fù)效果明顯。
圖7. 體內(nèi)水凝膠治療效果
圖8. 體內(nèi)腦出血小鼠模型的術(shù)后康復(fù)
8.DNA 水凝膠體內(nèi)治療和診斷的研究
基于核酸的可編程性，對 DNA 水凝膠核酸骨架進(jìn)行標(biāo)記熒光，通過 Cy3 標(biāo)記 Hb 適配體，BHQ2 標(biāo)記 S-B 鏈來重新編輯 DNA 序列，以實(shí)現(xiàn)自診斷。首先以膠原酶誘導(dǎo)再出血模型，考察 DNA 水凝膠在體內(nèi)的熒光變化，以健康小鼠為對照，結(jié)果證明再出血模型組的熒光強(qiáng)度明顯增加。為進(jìn)一步考察體內(nèi)的再診斷效果，建立自體血模型，將熒光標(biāo)記的 DNA 水凝膠注入不同體積的再出血模型中觀察熒光的變化，同時采用核磁共振（Magnetic resonance imaging, MRI）驗(yàn)證了小鼠腦部不同體積的出血量下，熒光強(qiáng)度的變化，表明 DNA 水凝膠的可依據(jù)于出血量的變化而給出相應(yīng)提示。為了考察 DNA 水凝膠的自治療效果，以自體血模型為實(shí)驗(yàn)對象，考察了再出血量和 Hb 變化，結(jié)果證明 DNA 水凝膠可明顯降低再出血量并顯著提高模型組的神經(jīng)功能恢復(fù)。DNA 水凝膠提高了 ICH 術(shù)后再出血的治療效果，為術(shù)后再出血的治療提供了新的思路。
圖9. 術(shù)后再出血的自我診斷和自我治療DNA水凝膠
本文構(gòu)建了用于腦出血術(shù)后再出血治療的原位植入 Hb 響應(yīng) DNA 水凝膠。該 DNA 水凝膠能夠特異性捕獲毒性 Hb 并診斷再出血的發(fā)生。此外，Hb的捕獲會觸發(fā) DNA 水凝膠從凝膠到溶膠的轉(zhuǎn)變，特異性地釋放 DFO，進(jìn)而避免破壞生理性鐵依賴功能。按需釋放的 DFO 可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞的鐵死亡來達(dá)到再出血的治療。DNA 水凝膠的應(yīng)用有望解決 ICH 患者術(shù)后再出血問題，同時，DNA 水凝膠為其他腦部手術(shù)治療也提供新的思路。對這一方向的深入研究和實(shí)際應(yīng)用可為各種腦部疾病的術(shù)后治療提供更有效、更安全的方法，也會推動患者的康復(fù)和提高患者生存率。
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In situ implantable DNA hydrogel for diagnosis and therapy of postoperative rehemorrhage following intracerebral hemorrhage surgery Wenyan Yu, Enpeng Gong, Changlin Wang, Chengyuan Che, Yuzhen Zhao, Xinyun Wu, Yi Yang, Haiyu Shi, Mengjuan Chen, Mingge Li, Li Xie, Yue Guo, Mingming Guo, Liya Mu, Zhenya Wang, Zhenzhong Zhang, Kaixiang Zhang, Junjie Liu, and Jinjin Shi
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado3919
