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北航樊瑜波教授、李曉明教授 AFM：構(gòu)建負(fù)載姜黃素的PLLA/PCL微納共軛纖維膜從多個角度協(xié)同防止術(shù)后粘連
2024-09-02  來源：高分子科技

  近期，北京航空航天大學(xué)樊瑜波教授和李曉明教授在Advanced Functional Materials上發(fā)表研究文章：構(gòu)建負(fù)載姜黃素的PLLA/PCL微納共軛纖維膜從多個角度協(xié)同防止術(shù)后粘連。


  采用疏水聚乳酸（PLLA）和聚己內(nèi)酯（PCL），利用共軛混紡技術(shù)構(gòu)建了負(fù)載姜黃素的PAPC微納共軛纖維膜。其能加強(qiáng)取向纖維對成纖維細(xì)胞行為的“接觸指導(dǎo)效應(yīng)”，即抑制細(xì)胞黏附、鋪展、增殖與分化。同時，相對取向纖維，有明顯改善的抑制蛋白質(zhì)吸附能力和力學(xué)性能。實(shí)驗(yàn)證明，其能有效防止腹腔和硬腦膜術(shù)后粘連，實(shí)現(xiàn)從提供物理屏障，提供特殊表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)調(diào)控細(xì)胞行為，以及賦予抗炎、抗氧化等生物化學(xué)功能等多個角度來防止粘連的發(fā)生。


摘要圖：與取向纖維膜相比，負(fù)載姜黃素的微納共軛纖維膜具有顯著改善的力學(xué)性能，可以從多種機(jī)制協(xié)同阻止POA，包括作為物理屏障，抑制蛋白質(zhì)吸附，實(shí)現(xiàn)抗炎、抗氧化、抗纖維化和抗菌功能，特別是增強(qiáng)AIFM的“接觸引導(dǎo)作用”以抑制成纖維細(xì)胞粘附、增殖和分化。


  術(shù)后粘連（Postoperative adhesion，POA）已成為一個常見但具有挑戰(zhàn)性的臨床問題。目前，大多數(shù)有關(guān)防粘連功能的研究主要是通過充當(dāng)物理屏障或抑制蛋白質(zhì)吸收來實(shí)現(xiàn)。然而，由于各種軟組織的生理環(huán)境各不相同，影響粘連形成的因素也復(fù)雜多樣，從單一角度防止不同軟組織的 POA 仍然很困難。因此，開發(fā)一種能夠從多個角度防止粘連的多功能防粘連膜，對不同軟組織的防粘連和修復(fù)材料具有重要意義。


  由于成纖維細(xì)胞在 POA 形成過程中起著至關(guān)重要的作用，研究人員試圖通過抑制成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞來預(yù)防POA。由定向纖維組成的取向纖維膜（anisotropic fibrous membrane，AIFM）已被證明可以通過“接觸引導(dǎo)效應(yīng) ”有效阻礙成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化。然而，取向纖維膜在對細(xì)胞行為的影響上表現(xiàn)出各向異性的同時，在力學(xué)性能上也呈現(xiàn)各向異性。其在與纖維取向方向垂直的方向上由于纖維之間缺乏相互糾纏的作用力，而表現(xiàn)出最為薄弱的力學(xué)性能，極易造成纖維膜結(jié)構(gòu)的破壞，使得細(xì)胞屏障作用失效，防粘連失敗。因此，必須在不影響取向纖維對于細(xì)胞行為的影響的同時，又加強(qiáng)取向垂直方向上的力學(xué)性能。


  取向纖維通過其特殊的表面拓?fù)湫蚊矊?xì)胞行為施加影響的過程稱為“接觸引導(dǎo)”效應(yīng)。大量研究表明，這一效應(yīng)和纖維的直徑息息相關(guān)，表現(xiàn)出明顯的“尺寸依賴效應(yīng)”。對于成纖維細(xì)胞而言，通常認(rèn)為亞微米而不是納米級別的靜電紡絲纖維膜才能為其排列和伸長提供有效的引導(dǎo)線索。因此，如果用與纖維軸向偏轉(zhuǎn)的納米纖維來纏繞微米尺度的取向纖維，有望在保持微米纖維對于細(xì)胞行為影響的同時，加強(qiáng)取向垂直方向上的力學(xué)性能。而在取向靜電紡絲的制備過程中可以發(fā)現(xiàn)，纖維取向度隨著收集轉(zhuǎn)筒轉(zhuǎn)速的增大而逐漸增高。在同樣轉(zhuǎn)筒轉(zhuǎn)速下，纖維直徑越大，取向度越高。因此，通過調(diào)整紡絲溶液的組成成份和電紡參數(shù)，有望在相同的轉(zhuǎn)速和電場下紡出取向程度不一致的微米、納米混合纖維膜，同時實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的細(xì)胞屏障和對成纖維細(xì)胞的“接觸引導(dǎo)效應(yīng)”。


  研究發(fā)現(xiàn)，粘連的發(fā)生和發(fā)展涉及到纖維蛋白的過度沉積、成纖維細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積、細(xì)胞外基質(zhì)的異常重塑，以及影響整個過程的慢性炎癥反應(yīng)、缺氧引發(fā)的氧化應(yīng)激、細(xì)菌感染等等。因此，引入具有抗炎、抗氧化、抗纖維化活性的姜黃素可以實(shí)現(xiàn)多功能，進(jìn)一步防止粘連的發(fā)生。


  本研究利用共軛混紡技術(shù)，通過調(diào)節(jié)各項(xiàng)制備參數(shù)，成功開發(fā)了聚乳酸-聚己內(nèi)酯微納共軛纖維膜（poly-L-lactic acid-poly (caprolactone) micro-nano conjugated fibrous membrane， PAPC MCFM）。其中，取向度較低的PCL納米纖維（118±12 nm）與取向度較高的PLLA微米纖維（2.0±0.3 μm）相交，對微米纖維起到約束和固定的作用。與此同時，制備了相同成份的取向纖維膜AIFM和無規(guī)纖維膜（isotropic fibrous membrane，IFM）作為對照。實(shí)驗(yàn)證明，MCFM具有最低的表面粗糙度，優(yōu)于AIFM的疏水性和抑制蛋白質(zhì)吸附的能力。（圖1）此外，它還大大提高了AIFM的機(jī)械性能（圖2）——在垂直于微米纖維取向的方向上，彈性模量、拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率分別提高了4.5倍、13.0倍和2.5倍，明顯改善了AIFM的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。好的疏水性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性使其不僅能作為堅(jiān)固的物理屏障，從而抑制 POA 的形成，還能滿足硬腦膜和膀胱等特殊組織修復(fù)的防滲漏要求。


圖1。PAPC MCFM的制備與表征。(A) PAPC MCFM結(jié)構(gòu)示意圖及SEM圖像；(B)表面形貌及特性。PAPC IFM、AIFM和MCFM的a) 掃描電鏡圖像和接觸角，b) 實(shí)時共聚焦顯微鏡圖像，c) 粗糙度分布；(C) 接觸角和粗糙度的定量分析；(D) 蛋白質(zhì)吸附能力檢測，包括吸附BSA的定量分析和吸附FITC標(biāo)記BSA的激光共聚焦圖像。


圖2。 PAPC IFM、AIFM 和 MCFM的力學(xué)性能分析。(A) a) 微米纖維取向平行方向上的拉伸曲線；b) AIFM 和 MCFM 在微米纖維取向垂直方向上的拉伸曲線和拉伸后的物理照片；IFM、AIFM 和 MCFM 在微米纖維取向（B）平行方向和（C）垂直方向上拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率和彈性模量。


  通過成纖維細(xì)胞的在不同纖維膜表面的黏附、增殖和分化研究發(fā)現(xiàn)，由微米纖維組成的AIFM對成纖維細(xì)胞具有明顯的“接觸引導(dǎo)效應(yīng)”，即引導(dǎo)成纖維細(xì)胞沿纖維取向方向?qū)R和伸長，使其保持紡錘體形態(tài)，通過抑制整合素β1的活化、紐蛋白的表達(dá)和粘著斑的形成以及YAP的核定位的活化，阻礙成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的粘附、增殖和分化。對于MCFM，貫穿微米纖維的納米纖維不僅沒有影響“接觸引導(dǎo)效應(yīng)”，反而進(jìn)一步增強(qiáng)了這種效應(yīng)，其對成纖維細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化的抑制作用顯著提高。（圖3和4）這些改善主要由于MCFM與AIFM相比密度更高、粗糙度更低、疏水性更強(qiáng)，從而降低了MCFM的蛋白質(zhì)吸附能力，增強(qiáng)了對細(xì)胞粘附的阻力。一方面，纖維膜表面蛋白質(zhì)吸附能力的降低會限制吸附蛋白質(zhì)與調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的特定受體的結(jié)合，從而影響細(xì)胞的粘附、遷移和增殖。另一方面，突出的防止蛋白質(zhì)吸附的能力可抑制纖維蛋白的過度沉積，從而有助于預(yù)防POA。此外，低的表面粗糙度為細(xì)胞提供更少的黏附位點(diǎn)，不利于其黏附、遷移、增殖與分化。


圖3。 成纖維細(xì)胞在PAPC IFM、AIFM 和 MCFM表面的粘附、遷移和增殖。(A) a) 掃描電鏡圖像，b) 細(xì)胞鋪展面積的定量分析，c) 整合素 β1 和 紐蛋白 表達(dá)； (B) 細(xì)胞遷移分析，a) 細(xì)胞骨架染色熒光顯微鏡圖像，b) 細(xì)胞遷移 48h 后在平行和垂直于微米纖維方向的細(xì)胞遷移面積定量分析；(C) a) 培養(yǎng) 1、3、5 和 7 天后的細(xì)胞 CCK-8 分析，b) 熒光顯微鏡圖像。


圖4。成纖維細(xì)胞在PAPC IFM、AIFM 和 MCFM表面向肌成纖維細(xì)胞的分化。(A) 不同PAPC 纖維膜表面細(xì)胞的 α-SMA 表達(dá)；(B) COL-Ⅰ 分泌；和 (C) YAP 核定位的激活。a) 表示 YAP 的免疫熒光染色；b) YAP 核定位激活比例的統(tǒng)計(jì)分析。


  炎癥已被確定為導(dǎo)致 POA 形成的重要因素，一些研究已經(jīng)通過開發(fā)抗炎生物材料來預(yù)防POA，并獲得了較好的效果。在這項(xiàng)研究中，姜黃素因其強(qiáng)大的抗炎和抗氧化特性而被負(fù)載到MCFM中。為獲得合適的姜黃素負(fù)載量，分別制備了負(fù)載0 mg/mL，0.5 mg/mL，2.5 mg/mL，5 mg/mL姜黃素的PAPC MCFM，并通過一系列的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，篩選出了具有相對最優(yōu)的抗炎、抗氧化、抗菌、抗纖維化效果的2.5 mg/mL姜黃素負(fù)載量，用于后續(xù)的體內(nèi)防粘連研究。（圖5）


圖5。PAPC MCFMs（cur）的體內(nèi)抗纖維化能力。(A）植入14天后，材料周圍組織中波形蛋白的a）免疫組化分析和 b）定量分析；（B）α-SMA 和膠原 I 的a）免疫熒光分析，b）膠原 I 和 c）α-SMA 的定量分析；（C）TGF-β1 的a）免疫組化分析和b）表達(dá)的平均面積。


  進(jìn)一步，將IFM，AIFM，MCFM，MCFM(cur) 分別植入大鼠腹腔和兔子硬腦膜下開展術(shù)后防粘連研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兔硬腦膜下和大鼠腹腔的防粘連情況相似，IFM，AIFM，MCFM，MCFM(cur) 的防粘連效果逐漸增強(qiáng)。在硬腦膜下（圖6），IFM組，膜與下方腦組織發(fā)生明顯粘連，其表面覆蓋著一層厚厚的組織，即使用鑷子也很難將其與腦組織分離；AIFM組的粘連程度較輕，表面黏附有一層薄組織，在鑷子剝離過程中，由于微纖維垂直方向的機(jī)械弱點(diǎn)，結(jié)構(gòu)發(fā)生了塌陷；MCFM與腦組織的粘連極小，它可以從腦組織表面完整剝離，但其表面有一些小血管。MCFM（cur）可以從下層腦組織完全剝離，表面光滑，且沒有血管或組織。在腹腔植入中（圖7），IFM表面有多個面積較大的足底粘連以及焦點(diǎn)粘連，并伴有富含血管的薄組織層；AIFM 表面足底粘連或焦點(diǎn)粘連明顯減少，表面的薄組織層血管較少；MCFM 組和 MCFM（cur）組中幾乎沒有粘連，不過，在MCFM組中，腹壁切口邊緣附近發(fā)現(xiàn)了一些組織，且表面有少量血管，而MCFM（cur）組顯示出明顯光滑的表面，沒有組織覆蓋，顯示了突出的防粘連效果。這表明 MCFM（cur）具有出色的抑制細(xì)胞在材料表面增殖和遷移的能力，因此特別適用于腹腔等大面積組織缺損的防粘連應(yīng)用，相比那些只證明了一定時間內(nèi)未形成粘連而沒有解決潛在的表面長期反應(yīng)的材料更有優(yōu)勢。


圖6。不同 PAPC 纖維膜植入兔硬腦膜下14天后的粘連情況。(A) a) 材料與腦組織粘連情況及切除的材料與粘連組織的直觀圖；b) HE 和 Masson 染色結(jié)果，紅色和藍(lán)色虛線分別表示材料與粘附組織的分界線和材料與硬腦膜組織的分界線！锉硎静牧，★表示附著的腦組織，紅色箭頭表示血管。(B) 不同組在兔硬腦膜下植入14天后的粘附評分。


圖7。不同 PAPC 纖維膜植入大鼠腹腔 14 天后的粘連情況。(A) a) 材料與腹腔內(nèi)盲腸組織粘連情況以及切除的材料與粘連組織的直觀圖，黃色圓圈代表粘附部位；b) HE 和 Masson 染色結(jié)果，黑色虛線為聚丙烯非生物降解網(wǎng)與纖維膜的分界線，藍(lán)色虛線為纖維膜與粘附組織的分界線，紅色虛線為粘附組織與盲腸的分界線，紅色箭頭代表血管，★表示材料區(qū)域，★表示粘附組織，★表示盲腸；(B)植入大鼠腹腔14 天后不同組的粘附評分。


  因此，PAPC MCFM（cur）可以作為堅(jiān)固的物理屏障，抑制蛋白質(zhì)吸附，并通過增強(qiáng)取向纖維提供的“接觸引導(dǎo)效應(yīng)”，有效抑制成纖維細(xì)胞的粘附、增殖和分化。此外，還能通過減輕炎癥和氧化應(yīng)激，并通過抑制TGF-β1的表達(dá)進(jìn)一步抑制纖維化。通過這些作用，從不同角度阻止了粘連的形成和發(fā)展。（圖 8）也就是說，MCFM（cur）通過多種機(jī)制協(xié)同阻止 POA 的形成。


圖8。PAPC MCFM（cur）預(yù)防POA的機(jī)制。MCFM和MCFM（cur）可增強(qiáng)AIFM的“接觸引導(dǎo)效應(yīng)”，通過抑制整合素β1的激活、紐蛋白的表達(dá)和粘著斑的形成、以及YAP的核定位激活，抑制成纖維細(xì)胞的粘附、增殖以及向肌成纖維細(xì)胞的分化。除了這些作用，MCFM（cur）還能從其他方面協(xié)同預(yù)防 POA，包括作為物理屏障、抑制蛋白質(zhì)吸附以及實(shí)現(xiàn)抗炎、抗氧化、抗纖維化和抗菌功能。


  總之，本研究成功制備了PAPC MCFM（cur），其在防止大鼠腹腔和兔硬腦膜的術(shù)后粘連方面表現(xiàn)出顯著效果。一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，PAPC MCFM（cur）能從多個角度協(xié)同防止 POA 的形成，這對開發(fā)各種軟組織的抗粘連和修復(fù)材料具有重要意義。此外，其獨(dú)特的微納共軛結(jié)構(gòu)還能為利用定向纖維來影響細(xì)胞行為的研究提供參考。同時，因其理想的疏水性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，PAPC MCFM（cur）也適合應(yīng)用于硬腦膜和膀胱等特殊部位。未來，將進(jìn)一步構(gòu)建基于 PAPC MCFM（cur）的防粘連、促再生的Janus 膜，以滿足特定組織的再生和機(jī)械要求。


  該研究獲國家自然科學(xué)基金（Nos. 32171345, 12332019, U20A20390），北京市科技新星計(jì)劃交叉合作課題（20230484464），霍英東教育基金（No. 141039），中國科學(xué)技術(shù)部航天生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)工程國際聯(lián)合研究中心，以及“111”項(xiàng)目（B13003）等的支持。


論文第一/通訊作者簡介


  廖婕（第一作者）：北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士研究生。主要從事硬腦膜修復(fù)體及多功能防粘連膜的研發(fā)工作。


  樊瑜波（通訊作者）：北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師，北京航空航天大學(xué)醫(yī)工交叉創(chuàng)新研究院院長、醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院院長、生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院院長，國家醫(yī)學(xué)攻關(guān)產(chǎn)教融合平臺（醫(yī)工結(jié)合）主任，北京生物醫(yī)學(xué)工程高精尖創(chuàng)新中心主任，生物力學(xué)與力學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任。長江學(xué)者，杰青，國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新群體帶頭人，科技部重點(diǎn)領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)帶頭人，國務(wù)院政府特殊津貼獲得者。美國醫(yī)學(xué)生物工程院（AIMBE）、國際醫(yī)學(xué)和生物工程科學(xué)院（IAMBE）、國際醫(yī)學(xué)物理與生物醫(yī)學(xué)工程聯(lián)合會（IUPESM）、國際生物材料科學(xué)與工程學(xué)會(FBSE) 會士。國務(wù)院學(xué)位委生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)科評議組成員。北航生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院創(chuàng)始院長；曾擔(dān)任中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會理事長（2008-2015）、世界華人生物工程聯(lián)合會（WACBE）主席、民政部國家康復(fù)輔具研究中心主任、附屬康復(fù)醫(yī)院院長（2015.1-2020.7） 等。從事生物醫(yī)學(xué)工程、醫(yī)療器械、康復(fù)輔具等領(lǐng)域研究。發(fā)表SCI論文400余篇(通訊或第一作者）、H因子83、Elsevier生物醫(yī)學(xué)工程高被引學(xué)者。授權(quán)發(fā)明專利200余項(xiàng)，獲部省級科技及教學(xué)獎勵13項(xiàng)。


  李曉明（通訊作者）：北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師、北京市科技新星、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才、霍英東青年教師基金獲得者，入選美國斯坦福大學(xué)與愛思唯爾數(shù)據(jù)庫發(fā)布的“World’s Top 2% Scientists 2023”的“career-long impact”及“single-year impact”名單。主要從事組織修復(fù)材料和組織再生工程等相關(guān)的教學(xué)科研工作，以第一或通訊作者發(fā)表SCI論文100余篇，被SCI他引5000余次，其中5篇超過200次，12篇超過100次，9篇被收錄為ESI高被引論文；出版中文專著2部、英文專著2部；現(xiàn)任中國生物材料學(xué)會智能仿生生物材料分會副主任委員，Tissue Engineering、中國修復(fù)重建外科雜志等國內(nèi)外雜志的編委，International Journal of Polymer Science、Biomimetics等SCI雜志的Lead Guest Editor；Science等雜志的稿件評審人。


  原文信息

  Liao J, Li XM, Yang HQ, He W, Wang BB, Liu SY, Fan YB. Construction of a Curcumin-Loaded PLLA/PCL Micro-Nano Conjugated Fibrous Membrane to Synergistically Prevent Postoperative Adhesion from Multiple Perspectives. 2024: 2407983. DOI: 10.1002/adfm.202407983

  原文鏈接 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202407983

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（責(zé)任編輯：xu）
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