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  華南理工大學唐本忠院士團隊秦安軍教授等人基于課題組前期工作,在活細胞內(nèi)開展了自發(fā)的炔-胺點擊聚合反應(yīng)，制備了分子量為7300的聚合物，并基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性實現(xiàn)了“點亮”型的細胞成像和對細胞的原位殺傷。

細胞內(nèi)化學反應(yīng)作為生物學研究的有力工具已被用于生物成像、疾病診斷和治療等領(lǐng)域。例如點擊化學、Staudinger ligation等反應(yīng)可以通過在細胞內(nèi)生物大分子上引入反應(yīng)性基團、熒光基團或藥物分子等，在研究復(fù)雜的細胞內(nèi)生理過程及疾病診療等領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。然而，金屬催化劑帶來的細胞毒性、引入反應(yīng)性基團帶來的繁瑣步驟及官能團反應(yīng)活性過高導(dǎo)致穩(wěn)定性差等問題限制了其應(yīng)用范圍。與此同時，聚合物相對于小分子體系具有更優(yōu)異的光物理性能和協(xié)同放大效應(yīng)，并可以解決小分子功能復(fù)合時的不足，因此在生物醫(yī)藥領(lǐng)域擁有著越來越寬廣的舞臺。但是，聚合物疏水的骨架結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其在生理環(huán)境中容易聚集從而不容易被生物體攝取和利用，且會面臨聚集導(dǎo)致發(fā)光猝滅(ACQ)等問題。而利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)材料獨特的光物理性能，發(fā)展一種在細胞內(nèi)原位制備具有AIE性能的聚合物的方法，具有很大的研究價值及應(yīng)用前景。

本工作中，基于該團隊前期發(fā)展的自發(fā)的炔-胺點擊聚合，結(jié)合細胞內(nèi)豐富的氨基這一事實以及AIE特性的四苯基乙烯基團的引入可實現(xiàn)高的聚集態(tài)發(fā)光效率、良好的光穩(wěn)定性和大的Stokes位移的特征，作者構(gòu)筑了“l(fā)ab-in-cell”。羰基活化的炔類單體可以自發(fā)地與含四苯基乙烯(TPE)的雙胺在細胞內(nèi)進行聚合并得到重均分子量(M_w)為7300的AIE聚合物(PAA)，并獲得了“點亮”型的熒光成像。同時，通過破壞細胞內(nèi)的微管蛋白導(dǎo)致細胞壞死，從而實現(xiàn)腫瘤細胞的殺傷。該策略為細胞環(huán)境中探索復(fù)雜的細胞內(nèi)活動提供了一種有效手段。

圖1 CLSM表征細胞內(nèi)聚合。單體1（A）、單體2（B）先后與細胞培養(yǎng)20 min后，繼續(xù)培養(yǎng)140 min（C）的成像圖；單體1（D）、單體2（E）及實驗制得的PAA（F）單獨與細胞作用的成像結(jié)果。 

作者進一步利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）成像表征了單體1和單體2的細胞內(nèi)聚合。為了避免兩種單體在培養(yǎng)基中相互反應(yīng)，實驗過程中兩種單體先后與細胞孵育，之后用PBS洗三次。由于PAA具有AIE特性，可以通過監(jiān)測熒光信號來研究聚合過程。如圖1A所示，在與單體1孵育后，只可以在HeLa細胞中檢測到微弱的綠色熒光，并且在加入單體2后熒光信號沒有增強（圖1B）。但隨著孵育時間的延長，熒光信號越來越強，3小時后便可以觀察到明亮的綠色熒光（圖1C）。相比之下，僅用單體1處理的細胞幾乎檢測不到熒光信號，這可能是因為小分子容易被細胞膜上的蛋白質(zhì)泵出。而僅用單體2孵育的細胞中也能觀察到與1類似的現(xiàn)象。上述結(jié)果表明，自發(fā)的炔-胺點擊聚合可以在細胞內(nèi)進行，并且基于所含的AIE基元可實現(xiàn)“點亮”型熒光成像。作為對照，作者將實驗制備獲得的PAA與HeLa細胞孵育，成像結(jié)果顯示其并不能穿過細胞膜，細胞內(nèi)沒有熒光信號，進一步表明細胞的熒光信號來源于單體1和2在細胞內(nèi)自發(fā)點擊聚合所得的PAA（圖1F）。

此外，作者將細胞裂解并進行相關(guān)處理后，用THF溶解沉淀物，并用凝膠滲透色譜測定分子量。結(jié)果顯示只有與兩種單體先后孵育的細胞組可以檢測到分子量為7300的產(chǎn)物，而其他對照組基本檢測不到大的分子量產(chǎn)物。作者還利用紅外光譜表征了細胞內(nèi)聚合產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中單體2的≡C-H（3225 cm^-1）和C≡C（2078 cm^-1）的伸縮振動峰消失，并伴隨著C=C（1603 cm^-1）伸縮振動峰的生成。該紅外光譜表征結(jié)果與在溶液中制備得到的PAA結(jié)果基本一致。以上實驗結(jié)果表明確實通過原位的細胞內(nèi)炔-胺點擊聚合制備了具有AIE性能的聚合物。

圖2 單體1（A）、單體2（B）及細胞內(nèi)聚合（C）的細胞毒性；空白組（D）及細胞內(nèi)聚合（E）的細胞分別用凋亡探針SR-DEVD-FMK及PI共染后的成像圖；(F)空白組及細胞內(nèi)聚合的HeLa細胞SEM表征圖。

 作者進一步通過MTT測定評估了細胞內(nèi)聚合產(chǎn)物的細胞毒性。鑒于培養(yǎng)基中存在的大量氨基酸，作者將單體分散在PBS中，并與HeLa細胞分別作用20分鐘，然后用新鮮培養(yǎng)基替換并孵育24小時。如圖2所示，單體1具有良好的生物相容性；而單體2在高濃度下展現(xiàn)出輕微的細胞毒性，這可歸因于通過其與蛋白質(zhì)氨基反應(yīng)封閉了細胞的一些功能。而當細胞先后與單體1和2作用后，再繼續(xù)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，細胞毒性明顯增加。通過凋亡試劑及掃描電鏡表征發(fā)現(xiàn)，該細胞內(nèi)聚合反應(yīng)誘導(dǎo)細胞死亡不是通過凋亡途徑，而是誘導(dǎo)細胞壞死達到細胞殺傷的效果。

綜上所述，作者在細胞內(nèi)實現(xiàn)了自發(fā)的炔-胺點擊聚合，不僅可以實現(xiàn)細胞的“點亮”型熒光成像，而且還可用于腫瘤細胞的殺傷。這種新型的“l(fā)ab-in-cell”擴展了點擊聚合在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用，為研究細胞內(nèi)的生理過程提供了強大的工具。

該成果以“Lab-in-cell based on spontaneous amino-yne click polymerization”為題，最新在線發(fā)表于Science China Chemistry, 并于2018年11月12日申請了中國發(fā)明專利保護。論文第一作者為華南理工大學胡蓉博士，通訊作者為秦安軍教授和唐本忠院士。

詳見：Hu Rong, Chen Xu, Zhou Taotao, Si Han, He Benzhao, Kwok Ryan Tsz Kin, Qin Anjun, Tang Ben Zhong. Lab-in-cell based on spontaneous amino-yne click polymerization. Sci. China Chem., 2019, DOI:10.1007/s11426-019-9517-9.

  論文鏈接：https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11426-019-9517-9