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  人胰島淀粉樣多肽(hIAPP)的錯誤折疊與聚集可對胰島β細(xì)胞產(chǎn)生毒性，是2型糖尿病的重要誘因。因此，發(fā)展有效阻止hIAPP聚集的抑制劑能夠作為治療2型糖尿病的潛在藥物。肽類藥物與小分子比較具有高活性和生物安全性，并且能夠特異性識別淀粉樣蛋白，因此成為有發(fā)展?jié)摿Φ暮蜻x藥物。然而，多肽抑制劑通常疏水性強(qiáng)，水溶性低以及穩(wěn)定性較差，并且目前一些肽類抑制劑僅在接近化學(xué)計量比甚至更高濃度時才有效。因此急需發(fā)展一種能夠高效增強(qiáng)肽類抑制劑抑制效率的策略。

  前期羅亮、孟凡玲團(tuán)隊首次報導(dǎo)了具有多酚特征的酪氨酸寡肽作為hIAPP的有效抑制劑。它們可以通過酚-hIAPP 相互作用阻止 hIAPP 聚集。然而，含有過多酪氨酸單元（大于 3）的寡聚酪氨酸由于其增加的疏水性和強(qiáng)烈的自聚集傾向無法抑制淀粉樣蛋白生成。針對上述問題，羅亮團(tuán)隊與合作者在這項研究中合作發(fā)展了一種逐級增強(qiáng)寡聚酪氨酸效果的策略。由于其序列可編程性、構(gòu)象特異性以及互補決定區(qū) (CDR) 與抗原的高親和力，納米抗體成為增強(qiáng)寡聚酪氨酸抑制效果的有效策略。四聚酪氨酸 YYYY (4Y) 被嫁接到納米抗體的第三互補決定區(qū) (CDR3) 以構(gòu)建納米抗體 N4Y，從而固定4Y的構(gòu)象，增強(qiáng)其與 hIAPP 的結(jié)合親和力，初步增強(qiáng)4Y的抑制效果。接下來將 N4Y 與聚合物N,N-二甲基乙二胺改性的聚（丙烯酸）(PAA-DMA, or PD)偶聯(lián)，形成多價聚合物-納米抗體偶聯(lián)物 PAA-DMA-N4Y (PDN4Y), 以通過多價效應(yīng)實現(xiàn)對4Y 的二次活化（圖1）。

圖1. 納米抗體 N4Y 和多價大分子 PDN4Y 逐級增強(qiáng)IAPP聚集抑制效率的策略

  研究者利用分子動力學(xué)模擬以及ELISA實驗證實了4Y 片段與 hIAPP 之間的相互作用通過N4Y的構(gòu)象受限以及 PDN4Y 的多價效應(yīng)分級增強(qiáng)（圖2-3）。ThT熒光動力學(xué)和TEM等生化實驗結(jié)果表明在非常低的化學(xué)計量濃度下，4Y 未能抑制 hIAPP 聚集，而 N4Y 有效地延遲了 hIAPP 聚集并部分減輕了 hIAPP 淀粉樣蛋白的生成。然而，PDN4Y 能夠通過構(gòu)象限制和多價的協(xié)同作用完全抑制 hIAPP 的聚集和淀粉樣蛋白生成（圖4）。

圖 2. (A) 4Y的構(gòu)象。(B) 4Y和hIAPP之間的結(jié)合。(C) N4Y模型，其中四個Y殘基沿CDR3的一側(cè)對齊。(D)N4Y和hIAPP之間的結(jié)合模式，其中4Y殘基（紅色）向外突出并通過疏水相互作用和 π-π 相互作用與hIAPP（綠色）相互作用。

圖3. 免疫印跡(A)和ELISA(B)分析hIAPP 與不同抑制劑之間的結(jié)合活性。

圖4. 4Y、N4Y和PDN4Y在不同摩爾比下對hIAPP淀粉樣蛋白生成的抑制作用。(A, B) 通過 ThT檢測hIAPP淀粉樣蛋白原纖維組裝的動力學(xué)。hIAPP: 抑制劑摩爾比分別為 20:1 (A) 和 40:1 (B)。(C) hIAPP 動力學(xué)實驗在不同抑制劑存在下的滯后期時間。(D) hIAPP在動力學(xué)實驗結(jié)束時的TEM圖像。

  研究者在細(xì)胞水平上驗證了這種策略對hIAPP寡聚體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的分級緩解。結(jié)果顯示hIAPP與大鼠胰島細(xì)胞共孵育產(chǎn)生50%的細(xì)胞毒性，加入4Y之后細(xì)胞活力沒有提升，加入N4Y細(xì)胞活力提升到60%，而加入PDN4Y之后細(xì)胞活力被挽救到80%以上（圖5）。

圖5. 在hIAPP:抑制劑摩爾比分別為20:1 (A)和40:1 (B) 的情況下，通過 MTT 評估在不同抑制劑對hIAPP細(xì)胞毒性的分級緩解作用。

  迄今為止，大多數(shù)關(guān)于抑制人胰島淀粉樣蛋白纖維化的研究主要是在細(xì)胞水平或體外實驗中進(jìn)行的。最近，斑馬魚已被用作淀粉樣變性研究的體內(nèi)模型。研究者最后使用斑馬魚胚胎來評估不同抑制劑在體內(nèi)減輕 hIAPP 淀粉樣變性誘導(dǎo)的毒性方面的功效。結(jié)果顯示多價大分子PDN4Y能夠通過構(gòu)象限制和多價的協(xié)同作用有效減輕 hIAPP 介導(dǎo)的毒性和斑馬魚胚胎中活性氧 (ROS) 的產(chǎn)生。

圖6. 斑馬魚胚胎毒性和活性氧 (ROS) 生成的體內(nèi)檢測。(A-B)毒性測定(A)和ROS生成測定(B)的斑馬魚實驗設(shè)計示意圖。(C) 72 hpf時存活和死亡胚胎的數(shù)量。 (D) DCF檢測ROS生成。 (E)健康和死亡胚胎的代表性圖像。(F)通過熒光顯微鏡檢查胚胎ROS生成。

  綜上，本研究利用結(jié)構(gòu)、生化、細(xì)胞和斑馬魚模型，成功地發(fā)展了一種能夠分級增強(qiáng)寡聚酪氨酸抑制 hIAPP 淀粉樣蛋白生成的策略，同時也發(fā)展了一種針對hIAPP聚集的高效抑制劑，對2型糖尿病預(yù)防與治療具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。本研究對其它以淀粉樣蛋白沉積為靶點的退行性疾病也提供了一種全新的治療與預(yù)防思路。

  上述研究成果在《ACS Nano》在線發(fā)表，題為“Hierarchical Vitalization of Oligotyrosine in Mitigating Islet Amyloid Polypeptide Amyloidogenesis through Multivalent Macromolecules with Conformation-Restrained Nanobody Ligands”。華中科技大學(xué)博士生辛彥儒和汪盛副教授為論文共同第一作者，華中科技大學(xué)羅亮教授和孟凡玲副教授為論文共同通訊作者。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、國家基礎(chǔ)研究計劃、湖北省自然科學(xué)基金和中央高�；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項基金的資助。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1021/acsnano.1c03083