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  自3D 生物打印首次被報(bào)道后，該領(lǐng)域得到迅速發(fā)展。相較于傳統(tǒng)的組織工程，3D生物打印具有能夠制造特定結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)，是有望能轉(zhuǎn)化進(jìn)入臨床應(yīng)用的生物制造方法。然而截至目前很少有真正進(jìn)入臨床試驗(yàn)的研究，究其原因在于研究3D生物打印的科學(xué)家和臨床醫(yī)生所關(guān)注的點(diǎn)不同，導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一。如何跨越這道鴻溝，步入臨床應(yīng)用的通途是3D生物打印領(lǐng)域接下來面臨的挑戰(zhàn)。作為生物打印的主體，生物墨水的角色尤其重要。3D生物打印的臨床轉(zhuǎn)化與新一代的生物墨水的開發(fā)密不可分。對(duì)此，弗萊堡大學(xué)高分子研究所的Shastrilab對(duì)目前3D生物打印技術(shù)（擠壓成型式）進(jìn)行了總結(jié)并提出生物墨水開發(fā)的五個(gè)階段（TRL1-5），生物墨水需要具備的特性和標(biāo)準(zhǔn)化的工具，以期對(duì)未來研究3D生物打印的研究者提供一些參考（圖1）。

圖1 生物墨水開發(fā)的五個(gè)階段以及各階段涉及到的標(biāo)準(zhǔn)化工具

  此前有學(xué)者將生物墨水定義為“能夠適用于自動(dòng)化制造和成型的包含細(xì)胞的配方，可包含生物活性成分和生物材料”。這一定義強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞在生物墨水中的重要性。然而在真實(shí)的打印中，生物材料本身的作用不可忽視。在構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)的例子中，細(xì)胞的打印幾乎離不開生物材料的支撐。生物材料不僅扮演了傳遞細(xì)胞的作用，其本身對(duì)細(xì)胞和其他生物活性物質(zhì)的影響更是不容小覷。早在本世紀(jì)初年就有學(xué)者提出生物材料的指引作用，其給內(nèi)含細(xì)胞提供了機(jī)械力、物理、化學(xué)和生物信號(hào)。因此本文將生物墨水中的介質(zhì)（生物材料）比喻為空白的畫布，通過后期的控制和改性具有特定的生物學(xué)功能和理化特性，比如引入特殊的基團(tuán)控制其交聯(lián)機(jī)制，調(diào)控內(nèi)部原有基團(tuán)的比例而操控硬度，或者接枝生物小分子使其具備特定的生物功能。

  3D生物打印的臨床轉(zhuǎn)化可以借鑒組織工程的發(fā)展歷程，因?yàn)槎呔哂泻芏嘞嗨菩�。比如二者都涉及生物材料和�?xì)胞的應(yīng)用，都可應(yīng)用于組織的修復(fù)或替代。目前，組織工程領(lǐng)域已經(jīng)有產(chǎn)品進(jìn)入臨床應(yīng)用，但數(shù)量不多，其原因也在于當(dāng)時(shí)組織工程在快速發(fā)展后并沒有迅速設(shè)想到后期應(yīng)用的涉及的問題，以至于在后期轉(zhuǎn)化中出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化較慢的階段。所幸3D生物打印和除組織工程以外其他的一些領(lǐng)域都有交集，比如3D打印，基因和細(xì)胞治療（圖2）。這三個(gè)領(lǐng)域目前都有用于臨床的產(chǎn)品，也有相應(yīng)的管理?xiàng)l例和標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)則，可以作為未來3D生物打印的轉(zhuǎn)化的借鑒。作為產(chǎn)品開發(fā)前端的科學(xué)家，一方面需要了解領(lǐng)域內(nèi)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定，讓研發(fā)對(duì)象從“學(xué)術(shù)可接受”轉(zhuǎn)化為“臨床可接受”，另一方面需要確保研發(fā)的內(nèi)容能夠在滿足科學(xué)和臨床規(guī)范的條件下順利進(jìn)入轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)線。

圖2 3D生物打印與其他已經(jīng)有進(jìn)入臨床應(yīng)用的技術(shù)（組織工程，3D打印以及基因和細(xì)胞治療）的交集

  生物打印的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為存活的組織，需要具備以下特點(diǎn)：在體外培養(yǎng)時(shí)保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠適應(yīng)手術(shù)移植過程中的各種操作，在相應(yīng)的移植部位存活足夠的時(shí)間。這些特征可總結(jié)為“3P特征”，即可預(yù)測(cè)的物理特性（predictable physical properties），可預(yù)測(cè)的生物反應(yīng)（predictable biological response）和可預(yù)測(cè)的體內(nèi)結(jié)果（and predictable in vivo outcomes）。為此，生物墨水不僅需要具有適合打印的理化性能，還需要具備促使組織再生的特性，能夠確保打印的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且能夠再移植后仍然保持活性和特定的生物功能，并且最終能夠轉(zhuǎn)化為具有功能的體內(nèi)組織。

  在生物制造過程中，生物墨水首先需要滿足一定的溫度特性。由于生物打印大多涉及打印細(xì)胞和生物活性分子，這些內(nèi)容對(duì)溫度要求比較苛刻。通常認(rèn)為最優(yōu)的打印溫度為人類生理溫度。一般過高的溫度不作推薦，原因在于高于生理溫度的條件下會(huì)引起細(xì)胞活動(dòng)的異常，如細(xì)胞內(nèi)鈣和鈉離子的升高，線粒體膜電位的升高，或活性氧簇水平的升高，這些都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡。在40℃時(shí)，細(xì)胞核可能發(fā)生變化；而更高的溫度（41℃）則可能在數(shù)分鐘內(nèi)直接導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。低于生理溫度的打印此前也有報(bào)道，但該溫度不能過低，因?yàn)檫^低的溫度也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凍傷和裂解。因此，推薦的打印溫度應(yīng)該介于室溫（細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)的溫度）與生理溫度之間。

  另外生物墨水還要達(dá)到醫(yī)療使用級(jí)別，這意味生物墨水需要無菌且沒有病原體。因此在材料的選擇上和化學(xué)制備中需要建立執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。材料本身是否含有病原體，化學(xué)合成的副產(chǎn)物和分解產(chǎn)物的水平都需要進(jìn)行規(guī)定和測(cè)量。在一些聚合物反應(yīng)中，如果有較多的單體或未反應(yīng)的催化劑的遺留，勢(shì)必對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。如何對(duì)生物墨水滅菌則是另一個(gè)難點(diǎn)。目前FDA批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)滅菌方法為0.22μm濾器過濾滅菌，高溫高壓滅菌和環(huán)氧乙烷滅菌。此前已有報(bào)道對(duì)這些方法進(jìn)行了比較，其結(jié)果顯示高溫高壓滅菌會(huì)破壞聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可能引起其性能的改變。而0.22μm濾器過濾只適合于粘度較低的液體，因此應(yīng)用有限。環(huán)氧乙烷可能是更安全而不引起物質(zhì)特性改變的方法。

  打印本身可以分解為三個(gè)過程：1.生物墨水從口徑較小的管道中擠壓出；2.瞬時(shí)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；3.長(zhǎng)期的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。因此要滿足3D生物打印的制造要求，生物墨水還需要具有剪切變稀，可控的膠化，對(duì)結(jié)構(gòu)的保真度和高穩(wěn)定度以實(shí)現(xiàn)上訴三個(gè)過程的順暢連接。文中以表格形式列舉了近五年來3D生物打印領(lǐng)域的研究成果，羅列了打印所用的材料，打印的結(jié)構(gòu)，是否為無支撐打印，采用的交聯(lián)方式等。

  生物墨水不僅要滿足制造的需求，也需要滿足生物性能的需求，從而達(dá)到組織再生。在組織再生過程中，免疫調(diào)控和血管化至關(guān)重要。現(xiàn)有證據(jù)表明，固有免疫和獲得性免疫都在組織再生的過程中有重要的作用。例如在固有免疫中巨噬細(xì)胞的極化是免疫調(diào)控的重要過程，通常M1型巨噬細(xì)胞提供了炎癥前的重要信息，而M2型巨噬細(xì)胞則與修復(fù)和再生有關(guān)。此外，組織再生還涉及調(diào)控型T細(xì)胞，其分泌的白介素參與到與再生相關(guān)的免疫抑制活動(dòng)中。實(shí)現(xiàn)器官型的血管化則是組織再生的另一難點(diǎn)。而血管化本身也和免疫調(diào)控藕連。如何實(shí)現(xiàn)二者的平衡以維持組織穩(wěn)態(tài)是未來面臨的挑戰(zhàn)（圖3）。

圖3 生物修復(fù)過程所涉及的免疫調(diào)控

  因此選擇合適的生物墨水的材料實(shí)現(xiàn)多種需求尤為關(guān)鍵。一直以來生物活性材料被認(rèn)為良好的選擇，因?yàn)樗鼈兙哂懈咏＝M織的成分，有較好的細(xì)胞親和力。但活性材料也存在一些劣勢(shì)，例如較差的可加工性，更有可能引起不良的排異和免疫反應(yīng)，無法控制的降解速率等等。而生物惰性材料由于不具備細(xì)胞粘附性和降解速度慢一直門可羅雀。實(shí)際上，生物惰性材料的優(yōu)勢(shì)在于來源充足，獲取廉價(jià)，可成型性好以及可修飾。文中列舉了本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的羧基化瓊脂糖生物材料，該材料不僅可以通過羧基化程度來調(diào)控成膠的硬度，還能接枝如RGD的小分子來提高細(xì)胞粘附力，并且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明該材料能穩(wěn)定存在，未引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，同時(shí)允許宿主細(xì)胞的進(jìn)入。

圖4 以羧基化瓊脂糖為例的生物惰性材料的開發(fā)過程

  針對(duì)上述提出的生物墨水需滿足的特性，文章最后提出三種開發(fā)性工具套件用于各階段研究的標(biāo)準(zhǔn)化。它們分別是流變學(xué)檢測(cè)，交聯(lián)策略（TRL1-2）和可用于體內(nèi)外研究的生物技術(shù)（TRL3-4）。流變學(xué)檢測(cè)可以提供充分的證據(jù)以支持生物墨水具有良好的可打印性能。這些檢測(cè)應(yīng)當(dāng)在確定了滅菌方法后進(jìn)行以確保獲得的數(shù)據(jù)為滅菌后材料的特性，同時(shí)這些檢測(cè)的設(shè)計(jì)應(yīng)盡可能模擬打印的條件而能真實(shí)反映生物墨水在加工過程中經(jīng)歷的變化。不僅如此，已有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的占比對(duì)生物墨水的流變學(xué)性能有影響。大量的細(xì)胞占會(huì)阻礙分子的交聯(lián)，改變成膠的硬度。在涉及高濃度細(xì)胞打印的研究中，對(duì)含有細(xì)胞的生物墨水進(jìn)行檢測(cè)不可或缺。選用交聯(lián)機(jī)制并制定最優(yōu)交聯(lián)策略不僅能減少打印過程對(duì)細(xì)胞的損害，還能提高產(chǎn)能。隨著新的聚合物的研發(fā)，打印硬件的升級(jí)以及高效的交聯(lián)劑的應(yīng)用，交聯(lián)過程并非一成不變。實(shí)時(shí)交聯(lián)，多重交聯(lián)機(jī)制的聯(lián)合應(yīng)用都能讓交聯(lián)變得高效而副作用降低。最后，打印的結(jié)構(gòu)能形成具有特定功能的組織還有待于體外培養(yǎng)和體內(nèi)培育的結(jié)果。在過往的很多研究中，3D生物打印的生物實(shí)驗(yàn)往往浮于表面，真正能推進(jìn)3D生物打印前進(jìn)的是更加嚴(yán)格和系統(tǒng)的生物實(shí)驗(yàn)。被打印的細(xì)胞能否維持其表型，能否分化成成熟的組織都需要更深入的研究。已經(jīng)有越來越多的研究表明細(xì)胞可以通過精密的力學(xué)傳導(dǎo)器感受外部環(huán)境的力學(xué)變化從而引起細(xì)胞核內(nèi)的變化。打印過程和生物材料的機(jī)械性能都能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，這些影響是否會(huì)改變細(xì)胞功能的表達(dá)有待揭示。事實(shí)上很多實(shí)驗(yàn)方法在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用已經(jīng)很成熟，而在3D生物打印中則并不多見；此外隨著表觀遺傳學(xué)和高通量測(cè)序的普及，這些檢測(cè)手段也變得更容易。在未來的研究中，這些研究方法都是3D生物打印的結(jié)構(gòu)能進(jìn)一步發(fā)展的重要基石。

  弗萊堡大學(xué)博士研究生顧亞偉為本文第一作者，弗萊堡大學(xué)講師Aurelien Forget博士為第二作者，Prasad Shastri教授為本文通訊作者。

作者團(tuán)隊(duì)簡(jiǎn)介：

  Prasad Shastri教授目前就職于德國(guó)弗萊堡大學(xué)高分子研究所，兼弗萊堡大學(xué)生物信號(hào)研究中心教授。Shastri教授1995年在倫斯勒理工學(xué)院獲博士學(xué)位，隨后在Robert Langer教授實(shí)驗(yàn)室做博士后研究。此后長(zhǎng)期致力于材料科學(xué)、修復(fù)醫(yī)學(xué)和腫瘤生物學(xué)的研究。目前實(shí)驗(yàn)室的工作重心為生物材料調(diào)控細(xì)胞微環(huán)境，體內(nèi)組織工程修復(fù)，腫瘤生物學(xué)，細(xì)胞治療和納米生物材料。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202103469