南丹麥大學(xué)吳昌柱教授團(tuán)隊《Nat. Commun.》：基于大腸桿菌化學(xué)修飾而成的人工孢子實(shí)現(xiàn)高效的界面生物催化
自然界中，生物體為了抵御環(huán)境中的不利因素，進(jìn)化出了各自的防御機(jī)制。這其中，細(xì)菌孢子可以抵御多種環(huán)境壓力，包括紫外光照射及化學(xué)試劑毒害，顯示了其在生物合成領(lǐng)域的潛力。但自然的孢子多處于休眠狀態(tài)，且其中的酶活性較低。為了解決這些問題，研究人員開發(fā)了人工孢子，即以保護(hù)性材料將細(xì)菌包裹于其中，保護(hù)細(xì)菌與酶的活性，有效提高生物催化效率，并拓展其在不對稱合成及生物燃料制造等領(lǐng)域的應(yīng)用。目前的人工孢子構(gòu)建主要基于天然細(xì)菌及其本身自帶的酶，這便大大限制了其在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。而相比之下，大腸桿菌作為最通用的重組酶表達(dá)平臺，則沒有在人工孢子化方面取得較大的進(jìn)展。
在此背景下，吳昌柱教授及其博士后孫志永(目前就職于浙江工業(yè)大學(xué))受自然界中細(xì)菌孢子可以抵御多種環(huán)境壓力（紫外光照射及化學(xué)試劑毒害）的啟發(fā)，利用聚多巴胺的良好生物相容性及保護(hù)性，包裹大腸桿菌的表面構(gòu)建人工孢子。該孢子體系可以有效抵御紫外光、高溫、有機(jī)溶劑、有機(jī)-水兩相界面張力的影響，維護(hù)細(xì)菌的代謝活性。同時，其內(nèi)部可以表達(dá)多種酶，并應(yīng)用于單酶及多酶的界面催化過程（圖1）。此外，該孢子可以負(fù)載化學(xué)催化劑，并成功構(gòu)建起化學(xué)-酶偶聯(lián)催化體系，進(jìn)一步豐富了細(xì)胞工廠的應(yīng)用。相關(guān)工作近日以“Artificially Sporulated Escherichia coli Cells as a Robust Cell Factory for Interfacial Biocatalysis”為標(biāo)題發(fā)表于《Nature Communications》。
圖1. 包裹大腸桿菌構(gòu)建人工孢子應(yīng)用于界面生物催化的示意圖。
人工孢子的表征
他們首先利用透射電鏡（TEM）和掃描電鏡（SEM）對人工孢子進(jìn)行了直觀的表征，并以原始的大腸桿菌作為對照。在TEM圖像中，可以看到細(xì)胞外的包覆層（圖2e,2f）,而原始細(xì)菌外則沒有。SEM表征中，可以直觀看到顆粒狀的包裹物和粗糙的表面（2g）,而原始細(xì)菌的表面相對光滑。綜合SEM和TEM，人工孢子的形成得到了有力的證實(shí)。
圖2. 人工孢子的表征。b-d:原始細(xì)菌。e-g:人工孢子。
生物相容性表征
之后，他們對包裹過程的生物相容性進(jìn)行了驗(yàn)證。在細(xì)菌活/死實(shí)驗(yàn)中，通過與原始細(xì)菌對比（圖3a），可以看到人工孢子有著較高的存活率（圖3b,綠色）。此外，人工孢子的繁殖能力也與原始細(xì)菌相當(dāng)（圖3c）。
圖3.生物相容性評價。a: 原始細(xì)菌。b:人工孢子。c:生長曲線。
保護(hù)性
為了研究人工孢子對各種環(huán)境壓力的抵御能力，他們分別施加紫外光、溫度、有機(jī)溶劑以及有機(jī)-水兩相界面張力等外界壓力。在細(xì)菌的死/活實(shí)驗(yàn)以及酶活穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，人工孢子的表現(xiàn)均大大優(yōu)于原始細(xì)菌（圖4）。例如，在紫外光照射下，原始細(xì)菌幾乎全部失去活性，而人工孢子則有超過85%的存活率（圖4b,4c）。此外，人工孢子中的酶活性也幾乎是原始細(xì)菌的2倍（圖4d）。在其他壓力環(huán)境下，人工孢子也有著相似的存活率和酶活性。
圖4.保護(hù)性評價。a-d: 原始細(xì)菌和人工孢子在紫外光照射下存活率以及酶活性。e-h: 原始細(xì)菌和人工孢子在兩相界面處存活率以及酶活性。
乳液表征
此后，他們通過對包裹材料組分的優(yōu)化，成功構(gòu)建了人工孢子穩(wěn)定的皮克林乳液體系。利用兩種不同的染料分別標(biāo)記有機(jī)相與水相，證實(shí)他們得到了水包油型乳液（圖5d）。此外，通過表達(dá)綠色熒光蛋白于細(xì)胞內(nèi)，可以看到人工孢子分布于有機(jī)-水兩相的界面上（圖5f, 5g），該發(fā)現(xiàn)也通過SEM得到了直觀的證實(shí)（圖5h）。
圖5.基于人工孢子的乳液的研究。
單步界面生物催化反應(yīng)研究
他們首先表達(dá)酯酶CalB于大腸桿菌中，隨后進(jìn)行表面包裹，構(gòu)建人工孢子。通過優(yōu)化人工孢子表面親疏水性、乳液體系的有機(jī)相-水相比例及人工孢子用量，該乳液體系的催化效率遠(yuǎn)高于其他兩組對照試驗(yàn)（圖6c）。此外，該人工孢子在重復(fù)多次利用的情況下，仍保持著較好的活性與催化效率（圖6d）。由于大腸桿菌是一種廣泛適用的酶表達(dá)平臺，他們又在其他兩種酶體系中進(jìn)行了界面催化的拓展，同樣顯示出遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于對照試驗(yàn)的結(jié)果（圖6f,6h）。值得注意的是，由于人工孢子始終保持著代謝活性，使其在涉及輔酶再生的反應(yīng)中，可以依靠自身的代謝路徑完成輔酶再生而無需其他輔助。這將大大降低反應(yīng)體系的復(fù)雜性和催化過程的成本，顯示了該體系獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢。
圖6.單步酶催化反應(yīng)的研究。a-d:基于脂肪酶CalB的乳液體系優(yōu)化、對比及重復(fù)利用。e-f:酶BAL的界面催化研究。g-h:酶ADH-a的界面催化的研究。
多酶界面生物催化的研究
在單酶反應(yīng)證實(shí)過可行性后，他們進(jìn)一步將反應(yīng)體系拓展到多酶催化。為此，他們以2種多酶耦聯(lián)催化反應(yīng)為研究對象，如圖7所示，證明了在界面催化體系中的反應(yīng)效率都遠(yuǎn)高于對照實(shí)驗(yàn)。
圖7.多酶催化反應(yīng)的研究。a-b:基于ADH-ht和CalB的多酶界面催化。c-d: 基于ADH-ht和BAL的多酶界面催化。
化學(xué)-酶耦聯(lián)界面生物催化的研究
隨后，他們進(jìn)一步以人工孢子為載體，負(fù)載了金屬催化劑鈀，并通過TEM進(jìn)行了鈀納米顆粒的分布表征（圖8b,8c）。值得注意的是，金屬催化劑的負(fù)載并沒有影響人工孢子的繁殖能力（圖8d）和乳化能力（圖8f）。此外，他們設(shè)計了化學(xué)-酶偶聯(lián)催化體系（圖8g），并進(jìn)一步證明了界面催化體系的優(yōu)越性（圖8h）。
圖8.化學(xué)-酶耦聯(lián)催化反應(yīng)的研究。a-d:負(fù)載鈀納米顆粒的人工孢子表征及其生長曲線。e-h: 負(fù)載鈀納米顆粒的人工孢子的乳液研究及其界面化學(xué)-酶耦聯(lián)催化研究。
他們利用生物相容性的聚多巴胺包裹大腸桿菌，構(gòu)建了可以抵御環(huán)境壓力的人工孢子，并通過在其內(nèi)部表達(dá)多種不同的酶，使其作為細(xì)胞工廠應(yīng)用于單酶、多酶以及化學(xué)-酶耦聯(lián)的界面生物催化過程。鑒于該細(xì)胞工廠的通用性以及化學(xué)催化劑的多樣性，可以展望，以人工孢子為基礎(chǔ)構(gòu)建的界面催化體系將為二者的結(jié)合提供更多的可能性，并有望應(yīng)用于解決合成工業(yè)上的難題。文章第一作者為孫志永博士，通訊作者為吳昌柱教授，通訊單位為南丹麥大學(xué)。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-30915-2
課題組介紹：
南丹麥大學(xué)化學(xué)系的吳昌柱教授課題組致力于酶催化及綠色化學(xué)的研究; 其研究重點(diǎn)是通過對酶及細(xì)胞的化學(xué)修飾獲得new-to-nature的生物催化應(yīng)用。詳情請參見：https://www.wugroup.sdu.dk/
希望對該組研究方向感興趣的研究人員與他們?nèi)〉寐?lián)系。該課題組現(xiàn)在資金充足、年輕、有活力，具有較好的發(fā)展前景；目前招聘多個全獎的博士和博士后位置；丹麥的博士生、博士后的質(zhì)量和待遇享譽(yù)全球。
孫志永博士目前就職于浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，任獨(dú)立PI。課題組長期招募有機(jī)合成、生物催化或自組裝等研究背景的青年教師及博士后，歡迎有興趣的研究人員與他們聯(lián)系。詳見：http://www.homepage.zjut.edu.cn/szy/cbb/
更多關(guān)于該工作的細(xì)節(jié)，請參考原文 DOI：10.1038/s41467-022-30915-2
