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天津大學(xué)王澤方教授團隊《Nat. Commun.》：工程化酵母全細(xì)胞催化系統(tǒng)實現(xiàn)高結(jié)晶PET塑料高效降解
2022-12-05  來源：高分子科技


  聚對苯二甲酸乙二醇酯 (Polyethylene terephthalate，PET) 是一種在服裝、包裝、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的塑料。然而PET產(chǎn)品因其極強的化學(xué)、物理穩(wěn)定性，使得它至少數(shù)百年才能在自然界中自發(fā)降解，這對全球生態(tài)安全和人類健康帶來了巨大威脅。近日，天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王澤方教授團隊設(shè)計并構(gòu)建了一種工程化的酵母全細(xì)胞生物催化劑，將PETase作為降解模塊、疏水蛋白HFBI作為吸附模塊共同展示在酵母細(xì)胞表面，創(chuàng)新性地在酵母細(xì)胞表面實現(xiàn)了吸附和降解這兩個步驟的有機統(tǒng)一。相關(guān)工作以《Biodegradation of Highly Crystallized Poly(ethylene terephthalate) Through Cell Surface Codisplay of Bacterial PETase and Hydrophobin》為題，于2022年11月21日發(fā)表在Nature Communications上。此研究是該課題組近兩年內(nèi)在生態(tài)安全領(lǐng)域（PNAS, 2021, 33876762; PNAS, 2021, 34620712；Nature Communications, 2022, 35338130）的又一重要進展。


  廢棄的PET應(yīng)該怎么回收處理呢？傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，近幾年“吃PET”的酶的相關(guān)研究為PET降解開拓了一種綠色道路，它能將PET分解為可重新利用的工業(yè)原料，而且同時具備傳統(tǒng)物理法工藝簡單和化學(xué)法閉環(huán)降解等優(yōu)點。但是目前利用“吃PET”的酶催化降解低結(jié)晶度的PET雖然已經(jīng)取得了長足進展，有些催化酶的應(yīng)用甚至已經(jīng)到達(dá)半工業(yè)化水平，然而對于高結(jié)晶度的PET（用來制作可樂瓶、礦泉水瓶等食品級容器），一直是這些降解酶“消化系統(tǒng)”的短板，降解能力十分有限。天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王澤方教授團隊通過將吸附模塊HFBI及降解模塊PETase共展示在酵母細(xì)胞表面，構(gòu)建全細(xì)胞催化系統(tǒng)，以解決現(xiàn)存“消化系統(tǒng)”的短板問題，在疏水性的PET界面充分發(fā)揮降解酶PETase“消化系統(tǒng)”對高結(jié)晶度PET的消化功能，以實現(xiàn)對hcPET的高效降解。


1、酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)的構(gòu)建


  王澤方教授團隊構(gòu)建的酵母全細(xì)胞催化系統(tǒng)同時在酵母細(xì)胞表面展示疏水蛋白HFBI和PET水解酶PETase，模擬PET降解的兩步過程，即吸附和水解，彌補現(xiàn)有研究對二者割裂以及主要集中在水解步驟的局限。具體實驗中，研究人員將人工設(shè)計的吸附模塊疏水蛋白HFBI和降解模塊PETase通過表面共展示技術(shù)固定到了畢赤酵母的細(xì)胞表面，并通過優(yōu)化，實現(xiàn)了二者在酵母細(xì)胞表面的最佳組合（圖1）。


圖1. 酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)。（a）吸附模塊疏水蛋白HFBI和降解模塊PETase結(jié)構(gòu)圖；（b）共展示系統(tǒng)示意圖；（c）HFBI和PETase通過表面共展示技術(shù)固定到畢赤酵母細(xì)胞表面在100 ns的分子動力學(xué)模擬示意圖；（d）不同誘導(dǎo)時間下展示在酵母細(xì)胞表面的HFBI和PETase免疫熒光圖。


2、疏水蛋白HFBI通過增加酵母細(xì)胞表面疏水性增加共展示細(xì)胞在PET表面的吸附


  通過Western blot和熒光共聚焦成像驗證吸附模塊疏水蛋白HFBI和降解模塊PETase成功展示在酵母細(xì)胞表面后，作者首先利用微生物對碳?xì)浠衔锏恼掣剑∕ATH）實驗（圖2a-2c），證明酵母細(xì)胞表面展示的HFBI是酵母細(xì)胞表面疏水性增加的原因；隨后，利用接觸角（WCA）實驗（圖2d-2e），進一步證明HFBI確實可以增加共展示細(xì)胞表面的疏水性；最后，為了確認(rèn)細(xì)胞表面展示的HFBI對細(xì)胞表面疏水性的影響是否可以轉(zhuǎn)化為對酵母細(xì)胞在PET表面附著的影響，作者觀察了在不同條件下共展示細(xì)胞在hcPET表面的吸附，發(fā)現(xiàn)共展示細(xì)胞幾乎覆蓋了hcPET的所有表面區(qū)域，而單展示PETase的對照樣品在相同的條件下在hcPET表面的吸附急劇減少（圖2f）。當(dāng)使用低濃度的相同的細(xì)胞進行結(jié)合測定時，也同樣發(fā)現(xiàn)類似的吸附差異（圖2g）。這些結(jié)果均說明吸附單元HFBI通過增加酵母細(xì)胞表面疏水性增加共展示細(xì)胞在PET表面的吸附。


圖2. 檢測共展示細(xì)胞表面疏水性。（a）MATH實驗示意圖；（b-c）誘導(dǎo)不同時間的共展示細(xì)胞MATH實驗結(jié)果；（d-e）接觸角實驗測量結(jié)果；（f-g）不同條件下共展示細(xì)胞及對照樣品在hcPET表面的吸附。


3、酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)具有高效降解活性


  作者隨后將構(gòu)建的酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)用于PET塑料降解。首先探索了共展示細(xì)胞水解hcPET的最佳條件，并與純化的PETase進行了比較。結(jié)果表明，溫度、pH、蛋白濃度（圖3a-c）均對共展示細(xì)胞及PETase的轉(zhuǎn)化率有明顯的影響，且在每種測試條件下，共展示細(xì)胞的酶活性均高于野生型PETase。最終測活結(jié)果顯示，全細(xì)胞生物催化劑對hcPET（結(jié)晶度為45%）的轉(zhuǎn)化率比野生型PETase提高約328.8倍（圖3d）。然后，作者用掃描電鏡和光學(xué)顯微鏡觀察了共展示細(xì)胞處理的hcPET的形態(tài)變化，使用PETase處理過的hcPET作為對照。如圖3e所示，在PETase處理的hcPET上幾乎沒有表面侵蝕，而共展示細(xì)胞處理后hcPET表面有明顯的裂紋和侵蝕。同時，該全細(xì)胞催化系統(tǒng)也表現(xiàn)出了較高的穩(wěn)定性，在10天長時間反應(yīng)條件下，與野生型PETase對hcPET轉(zhuǎn)化率0.003%相比，該全細(xì)胞催化劑將hcPET的轉(zhuǎn)化率提高到約10.9%（圖3f）。以上結(jié)果說明作者構(gòu)建的酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)能夠穩(wěn)定、高效的降解hcPET。


圖3. 酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)能夠高效降解hcPET。（a）溫度；（b）pH；（c）蛋白質(zhì)濃度對PET水解的影響；（d）最佳反應(yīng)條件下共展示細(xì)胞和野生型PETase以PET為底物的轉(zhuǎn)化率；（e）商用hcPET薄膜與PETase和共展示細(xì)胞孵育前后的SEM圖像；（f）最佳反應(yīng)條件下共展示細(xì)胞、單展示PETase細(xì)胞及野生型PETase長時間降解hcPET相對降解率。


4、酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)具有穩(wěn)定性


  為了測試該共展示細(xì)胞能否用于工業(yè)規(guī)模的全細(xì)胞生物催化劑，作者評估了與共展示細(xì)胞工業(yè)應(yīng)用相關(guān)的幾個特性，包括熱穩(wěn)定性、可重用性、化學(xué)或溶劑穩(wěn)定性、存儲條件。從圖4a可以看出，在30°C下孵育7天，共展示細(xì)胞的相對轉(zhuǎn)化率保持在100%，說明在這段孵育時間內(nèi)，酶活性幾乎沒有變化，而且回收7輪之后仍能保持50%酶活（圖4b）。圖4c顯示，當(dāng)共展示細(xì)胞在含有0.1% Triton X-100、10% 甲醇、10% 乙醇中培養(yǎng)時，仍能保持較高酶活。凍干是一種有利于共展示細(xì)胞儲存和運輸?shù)拿撍^程，從圖4d可以看出，冷凍干燥后共展示細(xì)胞對PET的轉(zhuǎn)化率仍然接近100%，說明全細(xì)胞生物催化劑在脫水后幾乎保留了全部的酶活性。綜上所述，構(gòu)建的酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)降解hcPET具有穩(wěn)定性。


圖4. 酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)降解hcPET具有穩(wěn)定性。（a）熱穩(wěn)定性；（b）循環(huán)使用性；（c）化學(xué)試劑對共展示系統(tǒng)的影響；（d）凍干對共展示系統(tǒng)的影響。


5、酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)降解hcPET的分子機制


  隨后，作者對該全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)降解hcPET進行了分子動力學(xué)模擬，提出共展示系統(tǒng)通過兩步降解hcPET的分子機制。首先，由于吸附模塊HFBI的存在，共展示細(xì)胞迅速吸附到hcPET表面，且在hcPET上的吸附率接近100%。隨后，降解模塊PETase接觸高結(jié)晶度PET的表面，并以順式構(gòu)象水解PET鏈，從而實現(xiàn)高結(jié)晶度PET的高效水解（圖5）。說明粘附模塊的引入是該系統(tǒng)高效降解hcPET的關(guān)鍵。


圖5. 全細(xì)胞催化系統(tǒng)水解hcPET示意圖。


  此項研究提供了一種高效生物降解hcPET的策略，證明了表面展示系統(tǒng)的可塑性，通過在表面展示系統(tǒng)中引入不同的功能模塊，可以大大提高其性能，對開發(fā)其它高性能協(xié)同表面展示系統(tǒng)具有重要的借鑒意義。


  文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-34908-z

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