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  免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）療法通過激活免疫系統(tǒng)來抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，已成為一種極具前景的治療策略。在眾多的檢查點(diǎn)中，程序性死亡配體1（PD-L1）被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)免疫抑制和腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，已被用作臨床治療實(shí)體腫瘤的治療靶點(diǎn)。目前，常用單克隆抗體或小干擾RNA（siRNA）來阻斷PD-L1/PD-1通路，但存在耐久性差、免疫反應(yīng)低等問題。因此，永久性、特異性地抑制腫瘤細(xì)胞中PD-L1基因的表達(dá)，有望實(shí)現(xiàn)更有效、更持久ICB治療。

  作為一種前沿的基因組編輯工具，聚類規(guī)則穿插短回文重復(fù)序列（CRISPR）-相關(guān)蛋白9（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)為癌癥的治療提供了新的思路。CRISPR/Cas9具有精確高效的基因編輯能力，能夠在sgRNA的引導(dǎo)下識(shí)別特定的DNA序列，并通過Cas9核酸內(nèi)切酶切割目標(biāo)PD-L1基因，調(diào)控腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。在腫瘤治療中，基于質(zhì)粒的CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低、整合效率高而被廣泛應(yīng)用。提高靶標(biāo)特異性和基因編輯效率是CRISPR/Cas9系統(tǒng)在免疫治療中的關(guān)鍵，因此迫切需要開發(fā)靶向腫瘤和響應(yīng)性的納米載體，以精確和有效地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)傳遞CRISPR/Cas9質(zhì)粒。

  研究團(tuán)隊(duì)通過¹H NMR、UV-vis和2D NOESY證明了金納米顆粒的成功包裹以及核殼樹狀大分子的成功構(gòu)建（圖2A-C）。TEM、AFM以及水合粒徑分布圖顯示出Au CSTDs呈球形，且大小均一（圖2D-F）。Au CSTDs的紅細(xì)胞溶血率低于5%，具有良好的血液相容性。此外，通過熒光光譜分析驗(yàn)證了苯硼酸酯鍵在低pH和高H₂O₂的響應(yīng)性斷裂，這將導(dǎo)致Au CSTDs在腫瘤微環(huán)境下發(fā)生pH和H₂O₂響應(yīng)性分解（圖2H和I）。 

圖2. (A) (Au⁰)₂₅-G5-LA、G3-PBA和Au CSTDs的¹H NMR譜。(B) G5-LA、(Au⁰)₂₅-G5-LA和Au CSTDs的紫外-可見光譜。(C) Au CSTDs的2D NOESY光譜。(D) Au CSTDs的TEM圖像和大小分布直方圖。(E)AFM圖像和Au CSTDs的高度輪廓。(F)各物質(zhì)在水中的水合粒徑圖。(G)不同濃度的Au CSTDs對(duì)小鼠的溶血率。陽性對(duì)照為1%的Triton X-100 (TX-100)，陰性對(duì)照為PBS。插圖顯示了與材料共孵育2小時(shí)離心后的照片。(H) Au CSTDs在pH為7.4、6.4和5.4時(shí)的熒光激發(fā)光譜。(I) Au CSTDs在含H₂O₂ (0.1 mM) pH = 7.4的熒光激發(fā)光譜。所有激發(fā)光譜均使用388 nm的發(fā)射波長。PBA的濃度固定在1 mM。

圖3. (A) Cas9-PD-L1質(zhì)粒和靶向PD-L1的sgRNA序列。(B)不同N/P比下， Au CSTDs壓縮Cas9-PD-L1質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠阻滯試驗(yàn)。1：DNA Marker (5000 bp)；2：游離Cas9-PD-L1；3?8：N/P比分別為0.125、0.25、0.5、1、2和5。(C) N/P = 10時(shí)，在不同環(huán)境下Au CSTDs壓縮Cas9-PD-L1質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠阻滯試驗(yàn)。(D)不同N/P比下Vector/Cas9-PD-L1的水合粒徑。(E)不同載體濃度的Vector、Vector/Cas9-PD-L1和Vector/ Cas9-NC處理的B16-F10細(xì)胞24小時(shí)的活力測(cè)定。Cas9-NC質(zhì)粒中的sgRNA被無序DNA取代。(F)在N/P分別為2、5、10、15、20和30時(shí)，PBS、Cas9-PD-L1和Vector/Cas9-PD-L1轉(zhuǎn)染B16-F10細(xì)胞后的代表性流式細(xì)胞儀圖和(G)相對(duì)平均熒光強(qiáng)度。

  研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步驗(yàn)證了Au CSTDs遞送CRISPR-Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制。T7核酸內(nèi)切酶I證實(shí)了該系統(tǒng)有效的基因編輯能力，它可以在DNA水平上顯著降低PD-L1基因。值得注意的是，用Au CSTDs作為載體遞送系統(tǒng)，比游離Cas9-PD-L1的對(duì)照組基因編輯效率增加了7.1倍（圖5A）。RT-PCR以及WB實(shí)驗(yàn)證明，CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以進(jìn)一步降低PD-L1基因的RNA水平以及蛋白質(zhì)水平（圖5B和C）。 

圖5. (A) PD-L1基因組位點(diǎn)的T7EI檢測(cè)，(B) PD-L1基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)，(C) PBS、Cas9-PD-L1、Vector/Cas9-PD-L1和Vector /Cas9-NC轉(zhuǎn)染后PD-L1蛋白表達(dá)的WB檢測(cè)。在(B)和(C)中，PBS處理的細(xì)胞表達(dá)量設(shè)為1.0。

圖6. (A)不同濃度的Au CSTDs和碘海醇中Au或I的的CT圖像和HU值。(B) B16-F10腫瘤模型瘤周注射Au CSTDs（[Au] = 5 mM）后，不同時(shí)間間隔的CT圖像和HU值。腫瘤區(qū)域用紅色圈出。(D)瘤周注射Au CSTDs后，小鼠主要器官和腫瘤在不同時(shí)間的Au含量的生物分布。

圖7. (A)體內(nèi)腫瘤免疫治療的示意圖及時(shí)間軸。小鼠的(B)相對(duì)腫瘤體積變化、(C)分離腫瘤的照片和重量以及(D)不同治療組的體重變化。每組6只小鼠。(E)第12天B16-F10腫瘤組織的H&E、TUNEL和Ki-67染色圖片。比例尺：50 μm。(F)腫瘤切片中TUNEL陽性細(xì)胞和Ki-67陽性細(xì)胞的百分比。

圖8. (A)腫瘤組織中PD-L1蛋白表達(dá)的圖像和定量分析。PBS處理的腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)設(shè)置為1.0。(B)腫瘤組織中PD-L1蛋白、CD4和CD8 T細(xì)胞的免疫熒光染色。比例尺：50 μm。脾臟中T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。(C) CD4⁺/CD8⁺ T細(xì)胞和CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ T細(xì)胞（Tregs）的點(diǎn)圖。(D) CD4⁺和(E) CD8⁺ T細(xì)胞的比例和(F) Tregs的比例。(G)第12天血清中TNF- α、(H) IFN-γ和(I) IL-6的定量分析。

  簡(jiǎn)言之，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的pH和H₂O₂敏感的Au CSTD納米材料可以壓縮和響應(yīng)性釋放CRISPR/Cas9質(zhì)粒，通過永久性和特異性地破壞腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)ICB治療。Au CSTDs/Cas9-PD-L1通過靶向過表達(dá)唾液酸被腫瘤細(xì)胞特異性攝取，隨著苯硼酸酯鍵的斷裂Cas9-PD-L1被響應(yīng)性釋放出來，并定位于細(xì)胞核有效地切割PD-L1基因。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，Au CSTDs/Cas9-PD-L1系統(tǒng)可以特異性聚集于腫瘤實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的CT成像，顯著降低腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達(dá)、誘導(dǎo)CD4⁺/CD8⁺ T細(xì)胞分布增加、減少免疫抑制細(xì)胞比例、上調(diào)細(xì)胞因子TNF-α/IFN-γ/IL-6，表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制效果。因此，本研究制備的Au CSTD納米材料為遞送CRISPR/Cas9質(zhì)粒用于ICB治療提供了新的思路。

  文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.2c22584