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復旦大學占昌友教授團隊：羥基PEG可規(guī)避人群預存抗PEG抗體 - 助力LNP高效遞送
2024-10-30  來源：高分子科技

  聚乙二醇（PEG）作為一種經典的生物醫(yī)用高分子輔料，廣泛應用于大分子藥物（如核酸和蛋白）或納米藥物的表面修飾（即PEG化），顯著提高藥物的水溶性并延長其血循環(huán)時間。然而，近年來在未使用過含PEG化藥物或藥物載體的健康人及臨床患者體內檢測到抗PEG抗體，即預存抗PEG抗體，且伴隨含PEG日化用品的使用增多、檢測抗PEG抗體技術手段進步等，預存抗PEG抗體的陽性檢出率及水平逐年增加。預存抗PEG抗體會與納米藥物表面修飾的PEG結合，激活補體系統(tǒng)，引發(fā)一系列下游的生物學效應，包括加速藥物的血液清除、增加非靶組織蓄積、形成膜攻擊復合物導致包載藥物提前泄漏、產生超敏反應等，嚴重影響納米藥物的療效與安全性。如何系統(tǒng)設計并開發(fā)可有效規(guī)避臨床預存抗PEG抗體的新型PEG輔料，是目前納米藥物遞送領域亟待解決的重要科學問題。


  鑒于此，復旦大學占昌友教授團隊通過對多中心臨床大樣本血清進行預存抗PEG抗體篩查，并考察其與不同PEG材料的結合活性，發(fā)現(xiàn)羥基PEG（OH-PEG）能有效規(guī)避臨床預存抗PEG抗體的結合。將市售脂質納米粒（LNP）配方中的甲氧基PEG（MeO-PEG）替換為OH-PEG，可顯著降低LNP在抗體陽性血清中的補體激活水平，減少過敏毒素的產生，并改善了LNP的血漿穩(wěn)定性，降低巨噬細胞的脫靶攝取，有望實現(xiàn)LNP的高效遞送，提升藥物體內性能。相關成果發(fā)表于bioRxiv平臺。


抗PEG抗體檢測方法優(yōu)化：0.05%Tween-20/PBS作為洗滌劑不影響抗體結合


  研究人員首先對抗PEG抗體的ELISA檢測方法進行了驗證與優(yōu)化，針對當前爭議較大的一個問題——含有乙二醇重復單元的Tween-20是否可以作為洗滌劑用于抗PEG抗體的檢測，進行了Tween-20和另一種被用于抗PEG抗體檢測的洗滌劑CHAPS的對比研究。研究人員在血樣孵育后加入不同濃度的Tween-20進行競爭結合，發(fā)現(xiàn)均不影響人血中預存抗PEG抗體與板中固定的PEG材料的結合，且在0.05%濃度以下不會影響動物體內抗PEG抗體和市售嵌合抗PEG抗體的結合。相反，使用CHAPS作為洗滌劑無法徹底去除板內非特異性結合的人IgG和HRP標記的二抗，從而嚴重干擾抗PEG抗體的正常檢測。最終，研究人員選擇0.05% Tween-20/PBS作為洗滌劑進行后續(xù)實驗。


圖1 Tween-20對抗PEG抗體檢測的影響


人群預存抗PEG抗體檢出率：18%人血樣本呈現(xiàn)結合強陽性


  研究人員選取目前市售PEG化制劑配方中的MeO-PEG作為抗原，利用ELISA檢測了2074例健康人血清中的抗PEG IgM和IgG水平，并選取125例樣本進行抗體滴度與1:4血清濃度時的吸光度值擬合，發(fā)現(xiàn)二者之間呈現(xiàn)良好的線性關系。這表明可以使用1:4血清濃度的吸光度值來代替滴度值，以進行大量樣本的篩選，從而反映抗體水平的高低。將吸光度值大于1定義為強陽性（++），吸光度值在0.5-1之間定義為陽性（+），吸光度值小于0.5定義為陰性（-），發(fā)現(xiàn)人群中預存抗PEG IgM的陽性率要遠高于抗PEG IgG。其中女性的抗體水平要高于男性，且呈現(xiàn)出隨著年齡增加抗體水平逐漸降低的趨勢。進一步對55例健康人不同時間點（大于3個月時間間隔）血清樣本進行抗體檢測，發(fā)現(xiàn)其抗體水平幾乎沒有變化，說明人體預存抗PEG抗體是持久存在的，可能對PEG化納米藥物產生長期影響。


圖2 人群預存抗PEG抗體檢出率


人群抗PEG抗體結合選擇性：羥基PEG可規(guī)避抗體結合


  研究人員選取了40例預存抗PEG抗體陽性樣本，利用ELISA檢測其與四種不同端基PEG材料（甲氧基、氨基、羧基和羥基）的結合活性。結果顯示，預存抗體與PEG的結合呈現(xiàn)出明顯的端基選擇性，其中MeO-PEG結合最強，OH-PEG最弱。進一步選取人群樣本中的所有抗體強陽性樣本及部分陰性樣本，對比甲氧基與羥基的結合活性，結果顯示預存抗PEG IgM及IgG均主要識別MeO-PEG，而OH-PEG可有效規(guī)避預存抗體。研究人員還利用等溫滴定量熱法（ITC）檢測抗PEG抗體與不同PEG材料結合時的放熱情況，發(fā)現(xiàn)人血樣本與OH-PEG滴定后釋放的熱量遠低于MeO-PEG，進一步驗證了OH-PEG規(guī)避臨床預存抗PEG抗體的結合。


圖3 人群預存抗PEG抗體的端基選擇性


OH-PEG構建的LNP能有效改善預存抗PEG抗體結合引起的不良效應


  基于上述發(fā)現(xiàn)，研究人員將市售脂質納米粒（Spikevax（Moderna））配方中的MeO-PEG替換為OH-PEG，考察其對預存抗PEG抗體結合及對下游生物學效應（如補體激活、血清穩(wěn)定性、靶細胞與非靶細胞攝。┑挠绊。結果顯示，OH-LNP吸附預存抗PEG抗體顯著減少，導致補體激活水平減弱，有望緩解因補體激活引起的臨床輸液反應和超敏反應等副作用。由于補體激活產物——膜攻擊復合物C5b-9的減少，OH-LNP在血清中的穩(wěn)定性提高，同時在不影響靶細胞（肝細胞）攝取的前提下顯著減少了巨噬細胞的攝取，有望避免LNP在體內被快速清除，提升藥物體內性能。


圖4 人群預存抗PEG抗體結合與下游生物學效應的差異


抗PEG抗體的結合位點存在物種差異


  由于目前缺乏對人群中預存抗PEG抗體起源與產生機制的充分認知，大多數臨床前試驗均采用PEG化納米載體（多為脂質體）來刺激產生抗PEG抗體。研究人員對小鼠、大鼠和比格犬體內經過刺激產生的抗PEG抗體進行考察，發(fā)現(xiàn)與人預存抗PEG抗體不同，動物體內經PEG化脂質納米載體刺激所產生的抗體主要結合乙二醇重復單元，對PEG末端基團無選擇性。進一步考察補體激活的物種差異，發(fā)現(xiàn)OH-LNP在小鼠和大鼠血清中增加了補體激活水平的跡象，在比格犬血清中與MeO-LNP的補體激活水平相當，而在人血清中補體激活水平顯著減少。這一現(xiàn)象與補體系統(tǒng)的物種差異有關？PEG抗體結合模式和補體激活途徑的物種差異可能會誤導研究者將注意力轉向被認為是惰性的MeO-PEG，從而阻礙OH-PEG的基礎研究、臨床開發(fā)與應用。


圖5抗PEG抗體的物種差異


羥基LNP免疫原性較低


  考慮到LNP在使用時往往需要重復給藥，因此在動物體內考察了重復注射LNP后抗PEG抗體的產生。研究發(fā)現(xiàn)，在比格犬中，重復注射MeO-LNP誘導了明顯的抗PEG IgM和IgG抗體，而OH-LNP產生的抗體水平較低，即免疫原性更低。在小鼠中，兩種LNP均未產生明顯的抗PEG抗體，這可能是由于PEG-DMG快速從LNP上脫落，以及小鼠對PEG材料相較于比格犬更不敏感所致。綜上所述，OH-LNP的免疫原性顯著低于MeO-LNP，有利于滿足臨床重復給藥的需求。


圖6重復注射LNP后在比格犬體內產生的抗PEG抗體水平


  本研究首次發(fā)現(xiàn)人群預存抗PEG抗體對PEG的結合具有端基選擇性，羥基PEG有能力規(guī)避預存抗PEG抗體的識別，從而顯著降低脂質納米粒的補體激活水平，改善下游生物學效應，對降低臨床脂質納米粒的副作用、提升臨床應用效果具有重要意義。


  原文信息：

  https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.10.21.619346v1

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（責任編輯：xu）
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