川大梁坤能副教授和鄧怡研究員團(tuán)隊(duì) Nano Lett.：特洛伊木馬生物異質(zhì)結(jié)賦予粘接性水凝膠強(qiáng)大的抗菌和傳感性能用于感染皮膚再生
傳統(tǒng)的粘接性水凝膠由于缺乏抗菌性能，限制了其在臨床醫(yī)療中的應(yīng)用。為了解決這一問(wèn)題，各種抗菌劑被添加到水凝膠中，其中以抗生素最為常見(jiàn)。然而，抗生素的濫用導(dǎo)致了耐藥細(xì)菌的發(fā)生和發(fā)展，且抗菌劑需要長(zhǎng)時(shí)間釋放才能發(fā)揮抗菌效果，這導(dǎo)致細(xì)菌感染時(shí)間延長(zhǎng)、組織修復(fù)難度增加。因此，有必要開(kāi)發(fā)非抗生素的殺菌策略賦予粘接性水凝膠敷料快速抗菌的能力。近年來(lái)，與光療相關(guān)的多模態(tài)抗菌治療已成為快速抗菌的常見(jiàn)策略。但是，熱休克蛋白的過(guò)表達(dá)增加了細(xì)菌的熱耐受性，削弱了光熱療法（PTT）的治療效果。光動(dòng)力療法（PDT）的抗菌效果也受到細(xì)菌抗氧化防御系統(tǒng)的影響。這導(dǎo)致單獨(dú)的光療已經(jīng)不足以完全根除細(xì)菌，需要與其他治療方式整合來(lái)解決光療的固有缺陷。
針對(duì)上述挑戰(zhàn)，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院梁坤能副教授與鄧怡研究員團(tuán)隊(duì)聯(lián)合開(kāi)發(fā)了一種特洛伊木馬生物異質(zhì)結(jié)（Th-bioHJ），該材料中的鎵(III)因其與鐵(III)的相似性，可以被細(xì)菌誤認(rèn)為必需的鐵元素而主動(dòng)攝取，進(jìn)而破壞電子傳遞鏈并抑制細(xì)菌呼吸，該策略被稱為 “特洛伊木馬策略”，將其與光療（PTT/PDT）結(jié)合可實(shí)現(xiàn)有效地快速消滅細(xì)菌。此外，該水凝膠能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)人體運(yùn)動(dòng)，適用于可穿戴傳感器。這項(xiàng)研究為粘接性水凝膠在感染性傷口管理中的應(yīng)用提供了全新的見(jiàn)解。
相關(guān)研究成果已發(fā)表在《Nano Letters》期刊上，論文題目為“Trojan Horse Bioheterojunction Empowers Adhesive Hydrogel with Robust Antibacterial Activity and Sensing Capacity for Infected Cutaneous Regeneration”。
Scheme 1. 特洛伊木馬生物異質(zhì)結(jié)粘接性水凝膠(bioHJ-CP)治療感染皮膚創(chuàng)面的示意圖。
在該研究中，研究團(tuán)隊(duì)將液態(tài)金屬和硫化銅構(gòu)成特洛伊木馬生物異質(zhì)（Th-bioHJs），并進(jìn)行了表征（圖1）。利用由卡拉膠（C）和聚丙烯酸（P）組成的粘接性水凝膠為載體，開(kāi)發(fā)出一種新型的bioHJ-CP水凝膠傷口敷料。
Figure 1. Th-bioHJ的合成和理化特征。(a) Th-bioHJ合成的示意圖。(b) Th-bioHJ的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像：紫色和藍(lán)色分別表示水熱反應(yīng)后液態(tài)金屬（LM）納米塊體和LM表面生長(zhǎng)的CuS納米顆粒。(c) Th-bioHJ的透射電子顯微鏡（TEM）和 (d) 高分辨透射電子顯微鏡（HR-TEM）圖像：Th-bioHJ中LM（001）和CuS（102）的晶體晶格。(e) Th-bioHJ的能量色散光譜圖：紅色、綠色、藍(lán)色、橙色分別對(duì)應(yīng)元素鎵（Ga）、銦（In）、銅（Cu）和硫（S）。(f) LM、CuS和Th-bioHJ的X射線衍射（XRD）圖譜。(g) LM和Th-bioHJ的X射線光電子能譜（XPS）圖譜。(h) Th-bioHJs中鎵（Ga）和(i) 銅（Cu）元素的XPS圖譜。
Figure 2. bioHJ-CP水凝膠的體外抗菌和抗生物膜能力。圖像顯示了(a)金黃色葡萄球菌(S. aureus)和(b)大腸桿菌(E. coli)在經(jīng)過(guò)對(duì)照組（無(wú)額外處理）、C、LM-C、CuS-C和bioHJ-CP水凝膠處理前后以及在近紅外(NIR)照射下的細(xì)菌菌落。SEM圖像展示了與對(duì)照組、C、LM-C、CuS-C和bioHJ-CP水凝膠孵育前后以及NIR照射后(c)金黃色葡萄球菌和(d)大腸桿菌的形態(tài)，三角形標(biāo)記表示細(xì)菌破裂。圖像顯示了(e)金黃色葡萄球菌和(f)大腸桿菌的活/死染色，活細(xì)菌呈綠色，死細(xì)菌呈紅色。代表性的(g)金黃色葡萄球菌生物膜和(h)大腸桿菌生物膜在經(jīng)過(guò)對(duì)照組、C、LM-C、CuS-C和bioHJ-CP水凝膠處理前后以及NIR照射后用結(jié)晶紫染色。(i)三維重建圖像展示了經(jīng)過(guò)處理的金黃色葡萄球菌生物膜，通過(guò)活/死染色可視化活細(xì)菌（綠色）和死細(xì)菌（紅色）。
通過(guò)大量體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，bioHJ-CP水凝膠在光照下，顯示出顯著的抗菌能力，有效清除細(xì)菌生物膜（見(jiàn)圖2）。對(duì)其抗菌機(jī)制探究如下：得益于Ga3?和Fe3?之間的高度相似性，Ga3?也被細(xì)菌鐵載體主動(dòng)結(jié)合并運(yùn)輸進(jìn)細(xì)菌內(nèi)。Ga3?的電荷更高且半徑（0.62 ?）比Fe2?（0.76 ?）更小，因此Ga3?-復(fù)合物可以產(chǎn)生更穩(wěn)定的離子鍵，具有更高的穩(wěn)定性。因此，Ga3?容易沒(méi)有氧化還原活性能力的Ga3?-卟啉環(huán)，通過(guò)“特洛伊木馬療法”破壞電子傳遞鏈并抑制細(xì)菌呼吸。為了探索bioHJ-CP水凝膠對(duì)細(xì)菌鐵代謝的影響，使用基于普魯士藍(lán)的Fe染色試劑盒評(píng)估了細(xì)菌對(duì)Fe3?的攝取。如圖S8所示，bioHJ-CP水凝膠孵育的細(xì)菌明顯減少了Fe3?攝取，在近紅外（NIR）照射后，細(xì)菌對(duì)Fe3?的攝取進(jìn)一步減少。定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析進(jìn)一步驗(yàn)證了在bioHJ-CP + NIR組中，與Fe3?運(yùn)輸相關(guān)的mRNA表達(dá)被補(bǔ)償性上調(diào)，包括fepC、fepD、fepG、fhuB和fhuC（圖3d）。細(xì)菌TEM的元素圖譜證實(shí)了Ga成功進(jìn)入并在細(xì)菌內(nèi)部積累（圖S15）。輔酶Q-細(xì)胞色素c還原酶（復(fù)合體Ⅲ）和細(xì)胞色素c氧化酶（復(fù)合體Ⅳ）是細(xì)菌電子傳遞鏈（ETC）的主要成分，對(duì)細(xì)菌中的電子傳遞過(guò)程至關(guān)重要。這些酶中的電子傳遞機(jī)制通常涉及卟啉環(huán)中鐵的氧化還原活性，該活性催化Fe2?向Fe3?的轉(zhuǎn)變，并伴隨著釋放單個(gè)電子。Ga3?-卟啉環(huán)阻礙了細(xì)胞色素酶?jìng)鬟f電子的能力，使細(xì)菌ETC陷入混亂。對(duì)復(fù)合體Ⅲ和Ⅳ的活性進(jìn)行了評(píng)估。在圖3e-h中，bioHJ-CP + NIR組在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)胞呼吸鏈中與復(fù)合體III和IV相關(guān)的酶活性顯著降低。復(fù)合體Ⅲ和Ⅳ活性的下降和細(xì)菌膜的破壞直接導(dǎo)致膜通透性增強(qiáng)和膜電位降低，采用了RB123和diSC3(5)檢測(cè)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的膜電位，發(fā)現(xiàn)bioHJ-CP + NIR引起的細(xì)菌呼吸鏈和細(xì)菌膜系統(tǒng)的嚴(yán)重破壞，最終導(dǎo)致細(xì)菌ATP水平明顯下降。大腸桿菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果也表明與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因上調(diào)和與ATP合成相關(guān)的基因下調(diào)，證明特洛伊木馬策略干擾電子轉(zhuǎn)移機(jī)制，損害了能量生產(chǎn)并破壞了微生物的生長(zhǎng)和代謝。
Figure 3. 抗菌機(jī)制。(a) 特洛伊木馬策略的示意圖：從bioHJ-CP水凝膠釋放的Ga3+作為特洛伊木馬導(dǎo)致細(xì)菌呼吸鏈混亂，其中Ga3+-卟啉環(huán)沒(méi)有氧化還原活性，無(wú)法傳遞電子。(b) 經(jīng)過(guò)C和bioHJ-CP水凝膠處理前后以及近紅外（NIR）照射后的金黃色葡萄球菌（S. aureus）的透射電子顯微鏡（TEM）圖像，紅色和綠色箭頭分別表示細(xì)菌細(xì)胞壁和質(zhì)膜收縮。(c) 經(jīng)過(guò)C和bioHJ-CP水凝膠處理前后以及NIR照射后的大腸桿菌（E. coli）形態(tài)的TEM圖像，紅色和綠色箭頭分別表示細(xì)菌細(xì)胞壁和質(zhì)膜收縮。(d) 定量聚合酶鏈反應(yīng)探索Th-bioHJs + NIR組中鐵離子運(yùn)輸相關(guān)mRNA表達(dá)，包括fepC、fepD、fepG、fhuB和fhuC。(e) 經(jīng)過(guò)bioHJ-CP和bioHJ-CP + NIR處理的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的輔酶Q-細(xì)胞色素c還原酶（complex Ⅲ）活性。(f) 經(jīng)過(guò)bioHJ-CP和bioHJ-CP + NIR處理的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)胞色素c氧化酶（complex Ⅳ）活性。(g) 經(jīng)過(guò)bioHJ-CP和bioHJ-CP + NIR處理的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中RB123的熒光強(qiáng)度。(h) 經(jīng)過(guò)bioHJ-CP和bioHJ-CP + NIR處理的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中的ATP水平。(i) 所有差異表達(dá)基因（DEGs）的GO富集評(píng)估。(j) 對(duì)前100個(gè)DEGs進(jìn)行聚類(lèi)分析，探索基因表達(dá)模式。熱圖中的行對(duì)應(yīng)基因，列對(duì)應(yīng)樣本，顏色強(qiáng)度反映基因表達(dá)水平。(k) 氧化磷酸化的基因集富集分析（GSEA）圖。(l) 在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中鐵離子吸收和運(yùn)輸途徑中涉及的基因的定量分析。(m) Th-bioHJs + NIR處理后的差異基因表達(dá)火山圖，藍(lán)色和紅色點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)下調(diào)和上調(diào)基因。(n) 前20個(gè)KEGG富集評(píng)估的氣泡圖，圓圈代表下調(diào)，三角形代表上調(diào)，大小表示涉及的基因數(shù)量。(o) 與碳代謝、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)圖。
Figure 4. C組、C+NIR組、bioHJ-CP組、bioHJ-CP+NIR組和萬(wàn)古霉素（Van）組感染傷口愈合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估。(a) 不同處理方法的金黃色葡萄球菌感染性傷口的實(shí)驗(yàn)流程圖。(b)從第0天至第6天在C組、C+NIR組、bioHJ-CP組、bioHJ-CP+NIR組和Van組中接受治療的感染性皮膚傷口照片。(c) 在C組和bioHJ-CP組中，經(jīng)過(guò)10分鐘近紅外（NIR）照射后傷口區(qū)域的熱成像圖。(d) 體內(nèi)實(shí)時(shí)光學(xué)成像追蹤了在C+NIR組、bioHJ-CP+NIR組和Van組中，用DiR碘化物標(biāo)記的金黃色葡萄球菌的抗菌效果。(e) 在第0天，C組、C+NIR組、bioHJ-CP組、bioHJ-CP+NIR組和Van組中感染性傷口組織中剩余活菌的數(shù)量。(f) 在第6天，新生皮膚中炎癥因子（IL-6（紅色）和TNF-α（綠色））的免疫熒光染色圖像。(g) 在第6天，新生皮膚中與血管生成相關(guān)因子（CD31（綠色）和α-SMA（紅色））的免疫熒光染色圖像。(h) IL-6、(i) TNF-α、(j) CD31和(k) α-SMA在第6天新生皮膚中的熒光強(qiáng)度的定量數(shù)據(jù)分析。
Figure 5. bioHJ-CP水凝膠傳感器在人體運(yùn)動(dòng)檢測(cè)中的應(yīng)用。(a) 用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)人體運(yùn)動(dòng)的可穿戴bioHJ-CP水凝膠傳感器的示意圖。(b) bioHJ-CP水凝膠粘附在豬皮和豬軟骨上的照片，在水下浸泡1小時(shí)后，無(wú)論如何扭曲，未觀察到水凝膠脫落和撕裂。(c) bioHJ-CP水凝膠傳感器在(Ⅰ)腕關(guān)節(jié)彎曲、(Ⅱ)肘關(guān)節(jié)彎曲、(Ⅲ)指關(guān)節(jié)彎曲和(Ⅳ)膝關(guān)節(jié)彎曲下的相對(duì)電阻變化。
在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種bioHJ-CP水凝膠，它具有快速、強(qiáng)大的抗菌作用和出色的傳感能力，用于治療感染性傷口。在近紅外（NIR）照射下，Th-bioHJs增強(qiáng)了光熱療法（PTT）的效率，催化了光動(dòng)力療法（PDT）的啟動(dòng)，并釋放了Ga3?，通過(guò)特洛伊木馬策略破壞了細(xì)菌的電子傳遞，迅速消除細(xì)菌。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，該水凝膠在NIR激光照射下顯著抑制了細(xì)菌定植和感染，刺激了血管生成，并促進(jìn)了傷口愈合。此外，這種粘接性水凝膠可以作為可穿戴傳感器，實(shí)現(xiàn)人體運(yùn)動(dòng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
文章第一作者為四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院2022級(jí)碩士研究生李夢(mèng)和楊英明，通訊作者為四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院的梁坤能副教授和四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院鄧怡研究員。特別感謝四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院徐欣教授和李繼遙教授的指導(dǎo)。本工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、四川省自然科學(xué)基金、四川省科技廳項(xiàng)目、四川省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、成都科技支撐計(jì)劃、四川大學(xué)研究項(xiàng)目和華西口腔醫(yī)院項(xiàng)目的資金支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c05560
