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  腦膠質(zhì)瘤是最具侵襲性和致死性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，目前治療腦膠質(zhì)瘤的主要手段包括手術(shù)、輔助放療和化療。近年來，盡管腦膠質(zhì)瘤的治療已獲得多方面的進展，但是由于血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的存在，導致進入顱內(nèi)腫瘤部位的藥物劑量仍然十分有限，因而腦膠質(zhì)瘤的診療仍存在較大的局限性。因此，開發(fā)新型高效的藥物遞送體系，使治療劑或造影劑跨越BBB輸送至大腦內(nèi)部進行腦腫瘤的精準診斷和高效治療顯得十分迫切和重要。細胞膜包覆法作為一種仿生策略在開發(fā)具有較高載藥量、增強腦靶向性的智能藥物遞送系統(tǒng)方面具有極大的潛力。據(jù)文獻報道，包覆了腦膠質(zhì)瘤細胞膜的仿生納米混懸劑可以進一步修飾靶向肽以用于穿越BBB并同源靶向腦膠質(zhì)瘤，進行原位腦膠質(zhì)瘤的有效治療。然而在這種情況下，需要在癌細胞膜上額外插入靶向肽才能實現(xiàn)BBB穿越。值得注意的是，巨噬細胞表面高表達的整合素α₄、β₁等，可以與腫瘤部位的血管內(nèi)皮粘附分子-1（VCAM-1）發(fā)生相互作用，促進巨噬細胞向腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤的遷移；而且巨噬細胞膜上的整合素α₄、β₁或巨噬細胞-1抗原（Mac-1）等在穿越BBB特異性靶向腦膠質(zhì)瘤中也起到至關(guān)重要的作用。因此，利用巨噬細胞膜仿生策略，有望協(xié)助納米藥物有效地跨越BBB，進行原位腦膠質(zhì)瘤的診療。

  近日，東華大學史向陽教授課題組和上海市第一人民醫(yī)院王悍教授合作，以還原響應(yīng)的聚N-乙烯基己內(nèi)酰胺納米凝膠（PVCL NGs）作為載體，通過在其內(nèi)部負載MnO₂和化療藥物順鉑，得到粒徑為106.3 nm的膠體穩(wěn)定性良好的NGs; 再在其外部包覆巨噬細胞膜，得到了巨噬細胞膜仿生多功能響應(yīng)型載藥納米凝膠（MPM@P NGs，圖1A），實現(xiàn)了MR成像實時監(jiān)測的原位腦膠質(zhì)瘤的聯(lián)合治療（圖1B）。

  制備的MPM@P NGs體系具有如下優(yōu)勢：

• （1）納米凝膠固有的流動性和變形性使其易于被細胞膜包覆；

• （2）利用巨噬細胞膜上的特異性蛋白（如整合素α₄、β₁等）與腫瘤部位的VCAM-1之間的作用，賦予其跨越BBB靶向腦膠質(zhì)瘤的功能；

• （3）含二硫鍵（S-S鍵）的N，N''''-雙（丙烯酰）胱胺（BAC）交聯(lián)的PVCL納米凝膠對腫瘤細胞中較高濃度的GSH（10 mM）具有還原響應(yīng)性，GSH可以使S-S鍵斷裂，納米凝膠瓦解，從而控制藥物在腫瘤位置的釋放；

• （4）MnO₂也可以與GSH反應(yīng)生成具有更高弛豫率的Mn²⁺（r₁= 9.69 mM^-1s^-1），Mn²⁺不僅具有優(yōu)異的MR成像效果，還可以與腫瘤微環(huán)境中的雙氧水（H₂O₂）發(fā)生類芬頓（Fenton-like）反應(yīng)，生成高毒性的羥基自由基（·OH）；

• （5）S-S鍵交聯(lián)的PVCL NGs和MnO₂通過下調(diào)GSH水平減少對·OH的消耗，有助于增強化學動力學治療（CDT）效果。

圖1. 巨噬細胞膜包覆的MM-Pt/MnO₂@PVCL NGs（MPM@P NGs）的制備路線示意圖（A），MPM@P NGs跨越血腦屏障進行原位腦膠質(zhì)瘤的MR成像和聯(lián)合化療/化學動力學治療應(yīng)用（B）。

  通常，腫瘤細胞內(nèi)高水平的GSH會將類芬頓試劑產(chǎn)生的·OH清除，降低其對腫瘤的殺傷效果。在該體系中，S-S鍵交聯(lián)的PVCL NGs和MnO₂通過消耗GSH有效減少腫瘤微環(huán)境中過量GSH對·OH的清除作用，從而進一步增強化學動力學治療效果。使用2′, 7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）作為熒光探針，通過激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）檢測經(jīng)不同材料處理后腫瘤細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況。如圖2 A-B所示，PBS處理的C6細胞中綠色熒光非常微弱，而Mn²⁺處理的C6細胞中顯示出比PBS對照組較強的DCF熒光，證實Mn²⁺通過類芬頓反應(yīng)可以將細胞內(nèi)的H₂O₂轉(zhuǎn)化為高活性的·OH。此外在M@P NGs處理的C6細胞中觀察到了明顯增強的DCF熒光，且顯著高于Mn²⁺處理組（p < 0.01），這可能是由于PVCL和MnO₂誘導的GSH清除效應(yīng)減少了過量GSH對·OH的消耗所致。他們通過測試細胞內(nèi)的GSH水平驗證了這一結(jié)果，如圖2 C所示，M@P NGs 處理的腦膠質(zhì)瘤細胞中GSH含量（63.6%）顯著低于Mn²⁺組（80.5%）。

圖2. 經(jīng)不同材料處理6 h后，通過CLSM觀察到的C6細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況（A）及各組細胞中的DCF熒光強度（B）；利用GSH/GSSG檢測試劑盒測得的C6細胞內(nèi)的相對GSH含量（C）。

  特別地，用負載了cisplatin的PM@P NGs處理的C6細胞中，綠色DCF熒光進一步增強（p < 0.05）。一種可能的機制是cisplatin可以激活NOX（一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族）使其將電子傳輸?shù)絆₂分子并生成O₂·^-，隨后O₂·^-可被超氧化物歧化酶（SOD）（Ma et al., Nano Lett., 2017, 17, 928-937）歧化產(chǎn)生H₂O₂，H₂O₂進而與Mn²⁺作用生成了更多的下游·OH。此外他們看到，經(jīng)MPM@P NGs處理的C6細胞表現(xiàn)出了最高的綠色熒光強度（p < 0.01），這可能是由于巨噬細胞膜的包覆改善了NGs的內(nèi)吞作用。

圖3. 體外BBB模型示意圖（A）；不同材料穿越BBB到達下室的Mn/Pt滲透百分數(shù)（B），C6細胞與滲透到下室的材料孵育24 h，通過流式細胞術(shù)檢測的細胞凋亡情況（C）以及各組凋亡細胞對應(yīng)的平均熒光強度（D），通過Western blot分析的凋亡相關(guān)蛋白的表達情況（E-G）。

  研究表明，巨噬細胞膜的包覆降低了納米藥物的非特異性蛋白吸附，延長了血液半衰期（t_1/2 = 3.37 h），并表現(xiàn)出良好的生物相容性。體外Transwell遷移實驗（圖3 A-G）和體內(nèi)原位腦膠質(zhì)瘤模型的MR成像（圖3 H-I）結(jié)果均顯示，巨噬細胞膜上的整合素α₄和β₁有效促進了NGs 跨越BBB并靶向腦膠質(zhì)瘤。MPM@P NGs跨越BBB到達下室的比例最高（Mn: 37.6 ± 0.93%，Pt: 32.6% ± 1.12%），并通過激活凋亡相關(guān)通路誘導更多的腫瘤細胞發(fā)生凋亡。進一步的體內(nèi)治療結(jié)果證明，由于增強的CDT/化療聯(lián)合治療和巨噬細胞膜輔助的BBB穿透/靶向作用等因素的影響，MPM@P NGs治療組呈現(xiàn)出最小的腫瘤體積和延長的存活期。

  以上研究以“Macrophage Membrane-Camouflaged Responsive Polymer Nanogels Enable Magnetic Resonance Imaging-Guided Chemotherapy/Chemodynamic Therapy of Orthotopic Glioma”為題，發(fā)表在SCI期刊ACS Nano（DOI: 10.1021/acsnano.1c08689）上。東華大學化學化工與生物工程學院博士研究生肖婷婷為第一作者，史向陽教授和上海市第一人民醫(yī)院的王悍教授為共同通訊作者。該工作得到了中德科學研究中心、國家自然科學基金、上海市科委優(yōu)秀學術(shù)帶頭人及中央高校研究生創(chuàng)新基金等項目的資助。

  文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsnano.1c08689