大連理工大學(xué)鄭楠/湖南大學(xué)邱燁 Biomacromolecules：具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的硫酸化糖基聚多肽的抗病毒活性研究
在世界范圍內(nèi)，病毒性疾病對人類健康產(chǎn)生日益嚴(yán)重的威脅，并造成了巨大的社會經(jīng)濟(jì)損失，尤其是近年在世界范圍內(nèi)大流行的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起了新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）。目前市售的小分子抗病毒藥物主要是采用兩種抗病毒途徑：細(xì)胞內(nèi)干擾病毒復(fù)制和細(xì)胞外阻止病毒和細(xì)胞相互作用。相較于小分子抗病毒試劑，大分子不僅具有結(jié)構(gòu)多樣性，還具有可調(diào)的聚合度、官能團(tuán)以及二級結(jié)構(gòu)等優(yōu)勢，這些優(yōu)勢能夠?qū)λ目共《净钚赃M(jìn)行有效的調(diào)控。細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素（HS）已經(jīng)被證明可以作為多種類型病毒的靶點(diǎn)，例如登革熱病毒、單純皰疹病毒、人乳頭瘤病毒等，而目前流行的SARS-CoV-2的刺突蛋白可以通過其受體結(jié)合域，獨(dú)立地與細(xì)胞表面的HS和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）相互作用，形成以HS為支架材料的三元復(fù)合物。這啟發(fā)我們通過引入外源性的HS模擬物去干擾和抑制該作用。與小分子相比，聚合物還具有"多價效應(yīng)"，通過重復(fù)單元或側(cè)鏈配體可以協(xié)同結(jié)合多個生物受體。與傳統(tǒng)聚合物相比，聚多肽具有良好的生物相容性和獨(dú)特的二級結(jié)構(gòu)，它的α-螺旋結(jié)構(gòu)能夠有助于側(cè)鏈的完全舒展，進(jìn)一步增強(qiáng)聚合物的多價效應(yīng)，有望作為聚合物基抗病毒試劑的骨架結(jié)構(gòu)（圖1）。然而，目前將聚多肽材料用于抗病毒方面的研究工作鮮有報道。
圖1 抗病毒機(jī)制和亮點(diǎn)總結(jié)
基于上述理論分析，最近，大連理工大學(xué)鄭楠課題組和湖南大學(xué)邱燁課題組合作開展具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的硫酸化糖基聚多肽的抗病毒活性研究。首先合成出一系列具有不同聚合度、構(gòu)型、剛?cè)嵝，?cè)鏈基團(tuán)（羧基、磺酸基、糖基和硫酸化糖基等）的水溶性聚多肽（圖2）。以SARS-CoV-2假病毒為模型，系統(tǒng)地研究了聚多肽結(jié)構(gòu)與抗病毒活性之間的關(guān)系，篩選出具有較強(qiáng)抗病毒活性的先導(dǎo)化合物L(fēng)60-SG-POB。此外，進(jìn)一步研究了硫酸化糖基聚多肽對真病毒，如無包膜腸道病毒（CVB3）的抑制作用，證明了聚多肽抑制病毒增殖的作用機(jī)制。
圖2 抗病毒聚多肽的結(jié)構(gòu)
作者通過圓二色（CD）光譜對所合成的聚多肽的構(gòu)型進(jìn)行表征（圖3）。除了采用DL-谷氨酸衍生物作為起始原料的DL58-G-POB和DL58-SG-POB，其余聚多肽均具有螺旋結(jié)構(gòu)。尤其糖基修飾的聚多肽能夠達(dá)到100%的螺旋度。由于陰離子的引入，硫酸化修飾引起螺旋度的降低，然而疏水作用的提高可以減弱這種效果。相較于具有長剛性側(cè)鏈的L(36, 60,102)-SG-POB，具有長柔性側(cè)鏈的L71-SG-AH的螺旋度降低幅度更大（72%）。
圖 3. （a-d） 聚多肽的CD。（e）L60-SG-POB 在H2O/MeOH中的CD。（f）L71-SG-AH 在H2O/MeOH中的CD。括號中數(shù)字代表螺旋度。
作者以SARS CoV-2假病毒作為模型，對聚多肽的抗病毒活性進(jìn)行研究（圖4）。首先對側(cè)鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，這些聚多肽均能夠?qū)Σ《井a(chǎn)生抑制效果，說明羧基、磺酸基和糖基都能夠起到抗病毒作用。其中，抑制率L60-SG-POB > L60-S-POB > L68-C-AP > L68-S-AP，與聚多肽的螺旋度結(jié)果一致，說明螺旋結(jié)構(gòu)也發(fā)揮了重要作用。由于各種聚多肽重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)差異，作者也從重復(fù)單元的摩爾濃度與硫酸基團(tuán)的摩爾濃度的角度分析，結(jié)果均證明L60-SG-POB的抑制效果最佳，說明糖基和硫酸離子的協(xié)同作用提高了聚多肽的抗病毒活性。
隨后，作者通過評價不同濃度下的SARS CoV-2假病毒抑制效率，確定L60-SG-POB的最佳劑量，結(jié)果顯示其半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.71 μg/mL，并且劑量為3 μg/mL時達(dá)到最大抑制效率。當(dāng)選擇更多類型的硫酸化糖多肽時，包括不同的剛?cè)嵝、?gòu)象和分子量，結(jié)果證實(shí)中等分子量具有與病毒更良好的親和力和合適的位點(diǎn)結(jié)合力。與無規(guī)卷曲構(gòu)型的DL58-SG-POB相比，具有螺旋結(jié)構(gòu)的L60-SG-POB展現(xiàn)更高的抑制率（85%），遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過市售的抗病毒試劑（肝素鈉），這主要是因?yàn)槁菪Y(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)硫酸糖的側(cè)鏈的舒展和暴露，從而增強(qiáng)多價效應(yīng)，提高位點(diǎn)結(jié)合力。具有柔性側(cè)鏈的聚多肽則顯示出較低的抑制率，這可能是因?yàn)殡x子的靜電作用和疏水作用對抗病毒效果均有影響。以上結(jié)果證明了螺旋構(gòu)型和硫酸化糖基側(cè)鏈能夠增強(qiáng)病毒的抑制作用（圖5）。
圖4. 聚多肽的抑制率，（a）質(zhì)量濃度為2 μg/mL；（b）硫酸基團(tuán)濃度為4.3 μM。
圖5. （a）L60-SG-POB的抑制率-劑量曲線。（b）硫酸化糖基聚多肽對新冠假病毒的抑制率。
為了進(jìn)一步研究這類聚多肽能否抑制真病毒的復(fù)制和增殖，作者選用了一種無包膜的腸病毒（CVB3）用于研究非膜的抑制效應(yīng)（圖6）。L60-SG-POB的抑制率-劑量曲線顯示其在10 μg/mL的劑量下達(dá)到最大抑制效果。無規(guī)卷曲構(gòu)型的DL58-SG-POB依然展現(xiàn)了最低的抑制率。L(36, 60,102)-SG-POB、L71-SG-AH展示了相似的抑制效果，卻低于市售的抗病毒試劑（肝素鈉）。不同于對具有包膜的假病毒的抑制效果，缺乏包膜的腸病毒經(jīng)常表現(xiàn)出不容易被聚多肽抑制，因此針對CVB3的IC50值相對較高。然而，在對CVB3的進(jìn)一步深入研究證明，硫酸化聚多肽具有干擾病毒內(nèi)化后復(fù)制或者增殖的能力。
圖6. （a）L60-SG-POB的抑制率-劑量曲線。（b）硫酸化糖基聚多肽對CVB3的抑制率。
綜上所述，聚多肽能夠抑制SARS-CoV-2的機(jī)制可能涉及硫酸化糖基聚多肽直接與病毒的包膜相互作用，從而阻隔病毒與受體的結(jié)合和膜融合。該研究為開發(fā)新型抗SARS-CoV-2的聚合物抑制劑提供了新的設(shè)計思路，并且證明了具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的硫酸化糖基聚多肽有望作為新型廣譜的抗病毒試劑。
相關(guān)成果發(fā)表在Biomacromolecules（Sulfated Glycomimetic α-Helical Polypeptides for Antiviral Activity, Articles ASAP, DOI: 10.1021/acs.biomac.3c00184），論文的第一作者為大連理工大學(xué)化工學(xué)院博士研究生徐翔；通訊作者為大連理工大學(xué)鄭楠副教授和湖南大學(xué)邱燁副教授。
論文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.biomac.3c00184
