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華南理工熊夢(mèng)華教授團(tuán)隊(duì) JACS：可電離基團(tuán)和疏水基團(tuán)交替排列的pH超敏膜裂解聚酯用于選擇性溶瘤治療的研究
2025-01-02  來(lái)源：高分子科技

  溶瘤療法通過(guò)裂解細(xì)胞膜并釋放胞內(nèi)內(nèi)容物（包括抗原、損傷相關(guān)模式分子等）殺傷腫瘤細(xì)胞，具有克服耐藥及增強(qiáng)抗腫瘤免疫治療的潛力。目前開(kāi)發(fā)的溶瘤材料主要包括溶瘤多肽和溶瘤高分子等，他們通常具有正電兩親性結(jié)構(gòu)，包含陽(yáng)離子和疏水基團(tuán)。溶瘤材料通過(guò)強(qiáng)靜電作用與負(fù)電性癌細(xì)胞膜結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)疏水作用將疏水片段插入磷脂雙分子層，誘導(dǎo)類似洗滌劑的膜裂解作用。這種機(jī)制有效地繞過(guò)了靶細(xì)胞復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，可以克服耐藥和代謝異質(zhì)性等問(wèn)題。盡管這些溶瘤材料的正電兩親性結(jié)構(gòu)對(duì)于破壞癌細(xì)胞膜至關(guān)重要，但其也會(huì)對(duì)健康組織細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的破膜活性，目前溶瘤材料局限于瘤內(nèi)給藥。鑒于腫瘤組織細(xì)胞是正常組織細(xì)胞癌化形成的，其細(xì)胞膜成分差異較小，且腫瘤組織（pH ~7.0-6.5）和正常組織（pH 7.4）之間微環(huán)境差異也較小，如何在腫瘤組織/細(xì)胞與正常組織/細(xì)胞之間微小差異下，實(shí)現(xiàn)高選擇性溶瘤治療是一個(gè)挑戰(zhàn)。


  團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)發(fā)了一類pH超敏溶瘤高分子，其可在正常組織和腫瘤組織微小pH變化下實(shí)現(xiàn)膜裂解活性的可控開(kāi)關(guān)，高選擇性在腫瘤酸度下裂解腫瘤組織細(xì)胞膜（Nature Nanotechnology, 2022, 17(5):541-551）。這類高分子包含親水聚乙二醇（mPEG）嵌段及pH響應(yīng)性膜裂解功能區(qū)（membranolytic block, MB），其中MB由側(cè)基含可質(zhì)子化三級(jí)胺及疏水基團(tuán)單體通過(guò)無(wú)規(guī)共聚形成。在正常生理環(huán)境下，三級(jí)胺的質(zhì)子化率很低，高分子自組裝成電中性的納米顆粒，惰性的MB鏈段被緊密的包裹在內(nèi)核，被PEG殼屏蔽，顯示低毒性。而當(dāng)pH降到閾值附近，pH的微小差異會(huì)引起材料質(zhì)子化率的突變，MB轉(zhuǎn)變成活性的正電兩親性結(jié)構(gòu)，同時(shí)材料轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚?/span>MB鏈段暴露的狀態(tài)，顯示高膜裂解活性。這類高分子可電離叔胺和疏水性基團(tuán)的種類、比例和分布顯著影響其表觀pKa、過(guò)渡pH（pHt）以及pH依賴的細(xì)胞毒性和選擇性。疏水基團(tuán)的比例只要改變10%，就能引起pKa中0.3-0.4個(gè)pH單位的位移，并顯著影響這些材料的細(xì)胞毒性和選擇性。這使其在臨床轉(zhuǎn)化中保證批次間結(jié)構(gòu)和功能的精確控制方面面臨巨大挑戰(zhàn)。


  考慮到可電離和疏水基團(tuán)之間的平衡對(duì)選擇性和膜裂解活性的關(guān)鍵影響，近日研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種可電離和疏水基團(tuán)交替排序的pH超敏感溶瘤聚酯（pOPs）。以mPEG113-OH為引發(fā)劑，通過(guò)鄰苯二酸酐與烯基或炔基官能化環(huán)氧化合物開(kāi)環(huán)交替聚合合成了交聯(lián)聚酯。隨后，通過(guò)巰基-烯或巰基-炔的鍵合反應(yīng)將可電離叔胺修飾到側(cè)鏈上。這些pOPs的膜裂解活性在0.2 pH單位內(nèi)從“OFF”急劇轉(zhuǎn)變?yōu)椤?/span>ON”。研究通過(guò)篩選獲得的性能最佳的P(P-AC7)66，具有優(yōu)異的pH選擇性破膜能力。值得注意的是，一旦聚合度大于49，P(P-AC7)的分子量對(duì)其pH依賴性細(xì)胞毒性的影響最小，確保了批次間性能的一致性。P(P-AC7)在pH 6.8時(shí)與磷脂酰絲氨酸相互作用發(fā)揮破膜活性，在多種腫瘤模型中均表現(xiàn)出較高的抗腫瘤療效。


圖1：pOPs的構(gòu)建。(a)以前報(bào)道的pH超敏無(wú)規(guī)共聚物。疏水基團(tuán)的比例只要改變10%，pKa值就會(huì)發(fā)生0.3-0.4個(gè)pH單位的變化，并顯著影響這些材料的細(xì)胞毒性和選擇性。(b)交替pH超敏溶瘤聚酯是由環(huán)氧化物和鄰苯二甲酸酐開(kāi)環(huán)聚合以及對(duì)側(cè)基進(jìn)行叔胺基修飾而得到的。這些pOPs具有精確控制的可電離和疏水基團(tuán)的比例和交替序列，在聚合度≥49時(shí)顯示出相似的毒性作用，確保了批次間性能的一致性。(c) P(P-A)66的13C核磁共振譜。(d) P(P-A)（低摩爾質(zhì)量）的MALDI-TOF譜。


圖2：P(P-AC7)66具有最佳的pH超敏選擇性。(a)聚酯的質(zhì)子化率隨pH的變化曲線。(b) Pan02GFP/mCherry細(xì)胞在不同pH條件下用160μgmL?1的聚酯孵育2h的高內(nèi)涵成像代表圖像；紅色熒光表示熒光蛋白mCherry，綠色熒光表示熒光蛋白MyrPalm-GFP。標(biāo)尺，40μm。(c)與聚酯孵育時(shí)mCherry的泄漏百分比。在pH6.8(d)和pH7.4(e)下孵育4小時(shí)后，聚酯對(duì)Panc02細(xì)胞的濃度依賴的細(xì)胞毒性。(f)經(jīng)靜脈給藥的ICR小鼠中聚酯的最大耐受劑量（MTD）。(g)pH為6.8時(shí)，P(P-AC7)66對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性隨濃度的變化。(h)pH為6.8時(shí)，P(P-AC7)66對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的IC50。(i)pH為7.4時(shí)，P(P-AC7)66對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性隨濃度的變化。(j)P(P-AC7)66在pH 6.8下孵育4小時(shí)后對(duì)Panc02細(xì)胞的細(xì)胞毒性與P（P-AC7）聚合度（DP）的關(guān)系。


圖3：PS有助于P(P-AC7)66的膜裂解活性。(a) pH為6.8和7.4時(shí)PS與P(P-AC7)66相互作用的ITC分析。(b) 在pH 6.8時(shí)，160 μg mL- 1 PS存在時(shí)，P(P-AC7)66對(duì)Panc02細(xì)胞的濃度依賴性細(xì)胞毒性。(c) 在pH 6.8時(shí)，在Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）存在下，P(P-AC7)66-cy5處理不同時(shí)間間隔的Panc02細(xì)胞的圖像。標(biāo)尺，10 μm。(d)  Panc02細(xì)胞中cy5、FITC和PI的相對(duì)MFI隨時(shí)間的變化。


圖4：P(P-AC7)66抑制腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)有效的抗腫瘤反應(yīng)。(a) Panc02腫瘤的治療方案（每組n = 7）。C57BL/6小鼠于第0天接種Panc02細(xì)胞。從第11天至第19天，每隔一天用0.9%氯化鈉溶液或P(P-AC7)66（40 mg kg -1）處理荷瘤小鼠。(b) Panc02腫瘤生長(zhǎng)抑制研究。治療后切除的Panc02腫瘤的重量(c)和圖像(d)。(e) 0.9%氯化鈉溶液或P(P-AC7)66（40 mg kg -1）給藥三次后采集的腫瘤組織的蘇木精-伊紅（H&E）染色；圖像比例尺為100 μm，放大圖像比例尺為25 μm。 (f) MC38腫瘤的治療方案（每組n = 6）。于第0天接種MC38細(xì)胞給C57BL/6小鼠。荷瘤小鼠于第4 ~ 8天每隔一天用0.9%氯化鈉溶液或P(P-AC7)66（40 mg kg -1）處理。(g) MC38腫瘤生長(zhǎng)抑制研究。治療后切除MC38腫瘤的重量(h)和圖像(i)。(j) EO771腫瘤治療方案（每組n = 7）。于第0天接種EO771細(xì)胞給C57BL/6小鼠。從第5天至第53天，每隔一天用0.9%氯化鈉溶液或P(P-AC7)66（40 mg kg -1）治療荷瘤小鼠。(k) EO771腫瘤生長(zhǎng)抑制研究。治療后切除的EO771腫瘤的重量(l)和圖像(m)。


  相關(guān)研究以“pH-Ultrasensitive Membranolytic Polyesters with Alternating Sequence of Ionizable and Hydrophobic Groups for Selective Oncolytic Therapy”為題發(fā)表在Journal of the American Chemical Society上。華南理工大學(xué)博士生汪吉紅與中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院博士后袁月玲，為論文的共同第一作者，華南理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院、國(guó)家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心熊夢(mèng)華教授為論文通訊作者。該工作受到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFB3804600），國(guó)家自然科學(xué)基金（52073102, 52273127, 32371389, 32171319，82371856），廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金（2023B1515020086, 2023A1515111158），廣州市GJYC項(xiàng)目，廣東省珠江人才計(jì)劃（2019QN01Y090）及廣東省科技規(guī)劃項(xiàng)目（2023B1212060013）的資助。


  論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c14199

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（責(zé)任編輯：xu）
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