1．引言
細胞功能通常是由生物分子之間的弱相互作用即非共價作用而引起的，如酶與底物、蛋白質(zhì)與配體、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及抗原抗體反應(yīng)。對這些弱相互作用的影響會導致疾病的發(fā)生。如ras-GDP(蛋白質(zhì)-配體)，γ-干擾素（蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)同源二聚體），FKBP-rapamycin（蛋白質(zhì)-抑制劑復合物）。生物學家們對這些作用正進行廣泛的研究以便更好地了解人體是怎樣起作用的及細胞功能失常是由什么原因引起的，更重要的是如何最有效地預防這些正常過程的改變而導致的疾病。
常規(guī)用于檢測非共價復合物的方法如凝膠色譜、超速離心、紅外光譜、差示紫外光譜、熒光光譜、園二色譜、X-晶體衍射及核磁共振等。但各有各的優(yōu)缺點。凝膠色譜、超速離心、紅外光譜、差示紫外光譜、熒光光譜、園二色譜等只能表明形成復合物后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，但提供很少或不能提供關(guān)于分子量及復合物化學計量結(jié)合數(shù)的信息。X-晶體衍射和核磁共振方法被用于測定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，可以提供詳細的結(jié)構(gòu)信息。但都很費時和復雜。X-晶體衍射只有在得到合適晶體的情況下才能應(yīng)用，但單晶的培養(yǎng)是很不容易的。核磁共振分析所用樣品量很大且不能分析分子量很大的復合物（大于40KD）。隨著近年來軟電離技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)非共價復合物研究方面顯示了一定的威力。
由于ESI是一項軟電離技術(shù)，因此很少使分子裂解產(chǎn)生碎片，因此非共價復合物能夠用ESI來研究。它能夠在非常接近天然溶液狀態(tài)的情況下研究復合物，能夠更加真實地反映生物大分子的生理狀態(tài)。到目前為止，用ESI觀察到的不同的復合物包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)（1,2），蛋白質(zhì)-配體（3~5），蛋白質(zhì)-寡核苷酸（6,7）和蛋白質(zhì)-雙鏈DNA（8）及蛋白質(zhì)-金屬離子復合物（9~11）？梢，ESI-MS已廣泛用于研究蛋白質(zhì)非共價鍵復合物。由于其具有靈敏度高、快速和質(zhì)量精確度高的優(yōu)點，結(jié)合物的化學計量比能夠很容易地從分子量推導出。通過改變Cone電壓、改變pH值和毛細管溫度，可以比較不同化合物與蛋白質(zhì)的親合力的大小（12）。通過與部分酶解和完全酶解相結(jié)合，還可以確定小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點（13）。總之，應(yīng)用ESI 研究蛋白質(zhì)復合物能夠在樣品用量少（皮克摩爾到亞皮克摩爾），快速的情況下得到可靠的數(shù)據(jù)和較多的信息。
基于ESI的許多優(yōu)點，美國一實驗室已致力于發(fā)展質(zhì)譜方法來研究生物大分子非共價復合物，以便尋找一種抗癌劑。他們的策略是從合成的或天然的資源中篩選能夠與致病蛋白非共價鍵結(jié)合的抑制劑，以便來干預致病機理（12）。該實驗室自1990年開始該項目以來，已用ESI研究了ras-蛋白和其配體GDP(14)和GTP（15）的非共價相互作用。在最近的工作中，他們用ESI檢測到了ras-GDP和有機抑制劑SCH54292和SCH54341的三元復合物，在三元復合物ras-GDP-SCH54292的研究中，他們還確定了藥物和ras蛋白的結(jié)合位點。從上述研究可以看出，ESI-MS作為研究蛋白質(zhì)非共價鍵復合物的工具，具有很好的應(yīng)用前景。
2．電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)的基本原理
ESI是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面積縮小，導致分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離子化的特點是產(chǎn)生多電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀都可以檢測的范圍，因而大大擴張了分子量的分析范圍。離子的真實分子量可以根據(jù)質(zhì)荷比及所帶電荷數(shù)計算出，一般由計算機軟件完成。電噴霧質(zhì)譜可忍受少量的鹽和緩沖液，但鹽和緩沖液的存在會使儀器的靈敏度降低。電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)點是它可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)用，如液質(zhì)聯(lián)用和毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用等。
3．電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)研究蛋白質(zhì)非共價復合物的實驗條件
電噴霧質(zhì)譜研究蛋白質(zhì)非共價鍵復合物成功的關(guān)鍵條件是很好的理解和調(diào)節(jié)儀器參數(shù)和樣品制備。一般情況下用電噴霧質(zhì)譜研究蛋白質(zhì)或多肽的最靈敏和最穩(wěn)定條件并不適用于蛋白質(zhì)非共價鍵復合物的研究。通常，用電噴霧質(zhì)譜研究蛋白質(zhì)時，樣品溶于含1%HCOOH 或1%HOAc的含一定比例乙腈或甲醇的水溶液中。這樣的條件對蛋白質(zhì)形成非共價鍵復合物是不利的，會破壞非共價鍵的形成。在接近生理pH時，蛋白質(zhì)保持有天然的活性構(gòu)象，才能形成非共價鍵復合物。因此，研究蛋白質(zhì)非共價鍵復合物時，樣品常溶于2-50mM NH4Oac或NH4HCO3中，pH在5-8之間比較合適。毛細管溫度或電噴霧源溫的高低對蛋白質(zhì)非共價鍵復合物也有影響。在能夠使樣品離子化的條件下，溫度越低越好。電噴霧大氣壓和真空之間的電壓或Cone電壓對復合物也有很大的影響，電壓高時會導致復合物的解離？傊，所有能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)變性的因素都不利于蛋白質(zhì)非共價鍵復合物的形成。PH值、有機溶劑、溫度和電壓是在研究蛋白質(zhì)非共價鍵復合物時要考慮的幾個重要因素。用電噴霧質(zhì)譜研究蛋白質(zhì)非共價鍵復合物的穩(wěn)定性也常常是通過改變這幾個條件來實現(xiàn)的。
4．電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)在蛋白質(zhì)非共價復合物研究中的應(yīng)用事例
自1991年Ganem（） 等最早應(yīng)用電噴霧質(zhì)譜研究蛋白質(zhì)FKBP12 和其配體FK506 和rapamycin 的非共價鍵復合物以來，該技術(shù)就被越來越多的學者所應(yīng)用。Smith 和Zhang（）、Loo()及Pramnik等（）相繼發(fā)表了很好有不同側(cè)重點的綜述。本人僅舉幾個典型事例來說明電噴霧質(zhì)譜在蛋白質(zhì)非共價鍵復合物中的廣泛應(yīng)用及其優(yōu)越性。
A. 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用
電噴霧質(zhì)譜在研究蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)方面顯示出了巨大的能力。蛋白質(zhì)復合物有同源和異源兩種。質(zhì)譜根據(jù)質(zhì)量的差別可以區(qū)分這兩種復合物。Brookhaven protein databank Brookhaven 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的所有蛋白質(zhì)中，33%的形成了多聚體復合物（a1）。在這些復合物中，80%的形成了二聚體或四聚體。電噴霧質(zhì)譜非常適用于鑒定蛋白質(zhì)的亞基數(shù)目。
Loo(a2)等報道了HIV整合酶突變體IN F185K同源二聚體的電噴霧質(zhì)譜研究。HIV整合酶在HIV病毒復制過程中起非常重要的作用，有可能成為一個新的抗愛滋病藥物的靶點(a3)。由于HIV整合酶的溶解度很小，因此不易搞清它的構(gòu)象。IN F185K是它的一個突變體，溶解度增大，但不影響其活性。研究表明，HIV整合酶以二聚體的形式起作用，與晶體結(jié)構(gòu)是一致的（a4-6）。在pH2.5的溶液中（乙腈：水=2:1v/v, 含3%乙酸），IN F185KIN F185K的電噴霧質(zhì)譜圖是單體的多電荷峰，所帶電荷從+12到+22，共11個多電荷峰。轉(zhuǎn)換后的分子量為18172.0。在酸性及有有機溶劑乙腈存在的條件下，IN F185K徹底變性，使蛋白中所有緘性氨基酸都暴露出來帶上質(zhì)子，因此形成了最高帶+22個電荷的11個多電荷峰。在pH6.5的10mM的乙酸氨溶液中，IN F185K的電噴霧質(zhì)譜圖是二聚體的多電荷峰，在m/z3000左右形成了三個多電荷峰，最高所帶電荷為+13。轉(zhuǎn)換后的分子量為36345.9。在pH6.5的10mM的乙酸氨溶液中，IN F185K保持有天然的活性構(gòu)象，形成結(jié)構(gòu)緊密的二聚體，只有暴露在分子表面的部分緘性氨基酸才能夠帶上質(zhì)子，因此僅有三個多電荷峰。增加IN F185K的濃度，并沒有觀察到其它非特異性的多聚體。將大氣壓和真空接口的電壓從50 增加到140，二聚體則降解為單體。
B. 蛋白質(zhì)和配體
Schwartz(b1)等用電噴霧質(zhì)譜研究了兩個小分子配體生物素（分子量244）和亞氨基生物素（分子量243）和一個由四個亞基組成的大蛋白鏈親和素核心core streptavidin （分子量53084）的非共價鍵結(jié)合行為。鏈親和素Streptavidin 和親和素一樣，與生物素由很特異、很強的親和力（Kd=10-15M）,這使得這一類非共價鍵復合物在生物化學和分子生物學，尤其是免疫化學和親和分離中的應(yīng)用非常的廣泛（b2-5）。而和亞胺生物素的親和力很弱（Kd=10-7M）。將配體和鏈親和素核心溶解于pH8.6 10mM的乙酸氨溶液中，配體和蛋白 鏈親和素核心core streptavidin的摩爾濃度比為7:1。在相同的實驗條件下進行電噴霧質(zhì)譜分析，結(jié)果表明，與已知的溶液中的結(jié)果一致，生物素和鏈親和素核心四聚體形成了4:1的非共價鍵復合物，而亞胺生物素和鏈親和素核心沒有形成復合物。只有在儀器界面條件極為溫和，配體濃度更高和孵育時間更長時才有部分亞胺生物素和鏈親和素核心結(jié)合，但結(jié)合并不完全。作者用熱誘導裂解還研究了配體和鏈親和素核心非共價鍵復合物的穩(wěn)定性，毛細管溫度升高時，復合物裂解，部分蛋白質(zhì)四聚體也解離為單體。作者還用負離子電噴霧質(zhì)譜研究了生物素化的寡核苷酸和鏈親和素核心的非共價鍵結(jié)合。與溶液中的行為一致，寡核苷酸和鏈親和素核心化學結(jié)合計量比為4:1。該實驗結(jié)果表明，用電噴霧質(zhì)譜研究大分子蛋白和小分子配體相互作用的結(jié)果和溶液中的行為是一致的，且靈敏、準確、快速，有很好的應(yīng)用前景。
C. 酶和抑制劑
HIV-1蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶家族的一個成員。該家族成員包括木瓜酶、腎素、凝乳酶及組織蛋白酶D等(c1)。HIV蛋白酶專一性地催化病毒 gag和gag-pol轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，產(chǎn)生裝配病毒顆粒所需要的酶和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。HIV-1蛋白酶活性在pH6時最高，將二聚體解離會導致酶活性的完全散失。胃蛋白酶抑制劑A（ isovaleryl-Val-Val-Sta-Ala-Sta, Mr686）是天冬氨酸蛋白酶的特異性抑制劑(c2-3)。HIV-1蛋白酶的活性位點有兩個亞基的相同部分組成。抑制劑和酶的反應(yīng)有氫鍵和疏水作用共同起作用。
Loo(a2)等用電噴霧質(zhì)譜研究了胃蛋白酶抑制劑A和HIV-1蛋白酶的結(jié)合與pH值的關(guān)系。在pH2.5的2.5% 乙酸溶液（乙腈：水=2：1）中，只有HIV-1蛋白酶單體的多電荷峰。最高所帶電荷數(shù)為13，共6個多電荷峰。將胃蛋白酶抑制劑A和HIV-1蛋白酶的乙酸氨儲備液混合后，用乙酸或氨水調(diào)節(jié)溶液的pH值并測定其電噴霧質(zhì)譜圖。在pH4.7-6.9的溶液中觀察到了胃蛋白酶抑制劑A和HIV-1蛋白酶二聚體的三元復合物，同時有HIV-1蛋白酶二聚體和單體的存在。酶與抑制劑的三元復合物在 pH5.5-6.0時最穩(wěn)定。該結(jié)果與以前Baca and Kent(c4) 報道的結(jié)果一致。酶與抑制劑的三元復合物對電噴霧質(zhì)譜的大氣壓真空接口條件很敏感，在低的 Vts(10V)和低毛細管溫度時（175）三元復合物的豐度最高。提高毛細管溫度會使三元復合物降解。
D. 抗原-抗體反應(yīng)
用電噴霧質(zhì)譜研究抗原抗體相互作用不僅靈敏、準確、快速，與酶解相結(jié)合還可以確定抗原表位及抗體互補位。MILLAR(d1) 等用電噴霧質(zhì)譜直接檢測到了一個新的能夠抑制HIV-I活性的有17個氨基酸組成的微抗體（ MicroAb）和代表從巴西（clade B）和非洲(clade A)分離出的第一代 HIV-1菌株V3區(qū)的肽(V3肽)的相互作用。該微抗體（ MicroAb）是一個能特異性地與HIV-1包膜糖蛋白gp120V3 環(huán)狀區(qū)作用的鼠單抗IGGI(F58)的重鏈第三補體區(qū)（CDR-H3）的一部分(d2)。它的活性比F58的高5倍。將MicroAb和V3肽溶解于pH7.0的50mM的乙酸氨溶液中，使?jié)舛确謩e為500ug/ml，37℃反應(yīng)1小時后進行電噴霧質(zhì)譜測定。觀察到了MicroAb和V3肽的復合物。但同時存在未結(jié)合MicroAb和V3肽，且復合物的豐度相對較低。可能是所用的載液（乙腈：水=1：1，含0.1%甲酸）不大合適，不利于復合物的形成。結(jié)果表明MicroAb是通過與病毒顆粒直接結(jié)合而介導病毒失活的。
將V3肽用胰蛋白酶進行完全酶解（37℃ 1小時）和部分酶解（4℃ 2分鐘）。然后將酶解肽段和MicroAb混合后在37℃反應(yīng)1小時后進行電噴霧質(zhì)譜測定。結(jié)果表明只有部分肽段與MicroAb結(jié)合。通過比較與MicroAb結(jié)合肽段的序列及進一步研究，證明MicroAb的抗原表位是RKSIXIGPGR。
該實驗結(jié)果說明用電噴霧質(zhì)譜研究溶液中抗原-抗體反應(yīng)是靈敏、快速、準確的方法。
E. 蛋白質(zhì)和寡核苷酸
蛋白質(zhì)和DNA的相互作用涉及到細胞過程的許多方面，因此具有重要的意義。化學結(jié)合計量是蛋白質(zhì)和DNA相互作用的一個重要特性。當一個樣品中含有不同的化學結(jié)合計量數(shù)或結(jié)合后分子量差別很小時，化學結(jié)合計量的測定就更為困難(e1)。電噴霧質(zhì)譜由于具有高靈敏度和高質(zhì)量準確度的優(yōu)點，因此可以很準確的測定其化學結(jié)合計量。
Cheng(e2)等用電噴霧質(zhì)譜研究了從細菌噬菌體分離的geneV蛋白和幾個寡核苷酸的化學結(jié)合計量數(shù)。在噬菌體的復制過程中Gene V 蛋白起穩(wěn)定單鏈DNA(ssDNA)的作用，并將合成的噬菌體DNA從雙鏈轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湣Ｒ阎?/SPAN>geneV蛋白在生理條件下主要以二聚體存在，Kd~-12 M。在pH7.0 10mM乙酸氨溶液中，無論是正離子還是負離子電噴霧質(zhì)譜，geneV蛋白都主要以二聚體存在。在負離子條件下，形成了最高所帶電荷為-8的四個多電荷峰。在pH3.0 50mM乙酸溶液中，形成了最高帶+14電荷的11個多電荷峰。這與酸致蛋白質(zhì)變性的結(jié)果一致。
將不同濃度比的geneV蛋白和16mer的寡核苷酸在pH7.0 10-50mM的乙酸氨中反應(yīng)10分鐘后進行電噴霧質(zhì)譜分析，結(jié)果表明gene V蛋白和16mer 寡核苷酸可以形成不同化學結(jié)合計量的非共價鍵復合物。主要是4:1(gene V :16mer I), 當寡核苷酸過量時，有少量2:1的復合物存在。
作者同時用電噴霧質(zhì)譜研究了gene V蛋白和 d (pT)13 、d (pT)15、 d (pT)18三個同源寡核苷酸的化學計量結(jié)合數(shù)。當gene V蛋白的摩爾濃度和 d (pT)13 、d (pT)15、 d (pT)18混合物的總摩爾濃度比為1:1 時， d (pT)18 主要形成4:1的復合物，而d (pT)13 和d (pT)15主要形成2:1的復合物。當gene V蛋白的摩爾濃度和 d (pT)13 、d (pT)15、 d (pT)18混合物的總摩爾濃度比為2:1時，d (pT)18 和d (pT)15形成4:1的復合物，而d (pT)13仍形成2:1的復合物。說明gene V蛋白和d (pT)13的主要化學結(jié)合計量數(shù)為2:1，和d (pT)18的為4:1,而和d (pT)15的化學結(jié)合計量數(shù)則根據(jù)寡核苷酸和gene V蛋白的相對濃度不同為4:1或2:1。
有文獻報道gene V蛋白與poly(dA)和poly(dT)的親和力相差兩個數(shù)量級。作者用電噴霧質(zhì)譜也得到了相同的結(jié)論。將gene V蛋白和d (pT)13 、d (pA)14的混合物
在pH 7.0 10mM乙酸氨溶液中進行電噴霧質(zhì)譜分析。當d (pT)13和d (pA)14摩爾濃度相同時，主要是gene V蛋白和d (pT)13 形成的2:1的非共價鍵復合物。幾乎沒有gene V蛋白和d (pA)14形成的復合物。當只有d (pA)14 時，gene V蛋白和d (pA)14可以很容易形成2:1的復合物。當d (pT)13和d (pA)14摩爾濃度為2:100時，gene V蛋白和d (pT)13 形成的2:1復合物的豐度是gene V蛋白和d (pA)14形成的2:1復合物的8倍。和濃度一起考慮，則gene V蛋白和d (pT)13的親和力是和d (pA)14親和力的400倍。
可見，電噴霧質(zhì)譜在研究蛋白質(zhì)和DNA 相互作用時有巨大的優(yōu)越性。
F. 金屬離子和肽
金屬離子在許多生物過程都起著非常重要的作用。它們通過觸發(fā)機理、穩(wěn)定結(jié)構(gòu)及控制氧化還原反應(yīng)來起作用。在所有的二價金屬離子中，鈣離子的作用最為重要。借助于細胞膜內(nèi)外的濃度差，鈣離子在調(diào)節(jié)細胞過程中常充當?shù)诙攀沟淖饔。其調(diào)節(jié)細胞的過程常涉及鈣結(jié)合蛋白質(zhì)（f1-5）。Veenstra(f6)等用電噴霧質(zhì)譜研究了鈣調(diào)蛋白和兩個肽的非共價鍵復合物。一個肽是鈣調(diào)素依賴的蛋白酶II的鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)，一個是毒蜂肽。只有在鈣離子存在時，鈣調(diào)素和兩個肽及鈣離子形成1:1:4(鈣調(diào)素：肽：鈣離子)的三元復合物。同時他們還證明三元復合物的穩(wěn)定性與電噴霧質(zhì)譜的源溫有關(guān)。 Nemirovskiy (f7)等用串聯(lián)質(zhì)譜（FAB和ESI）研究了以兔肌鈣蛋白的鈣離子結(jié)合位元點III為模型的一系列小肽和鈣離子復合物的高能和低能碰撞活化裂解行為。電噴霧質(zhì)譜中產(chǎn)生的鈣離子/肽段碎片有鈣離子結(jié)合控制，提供了鈣離子結(jié)合位點的信息。表明鈣離子結(jié)合位點涉及到一個天冬氨酸、一個谷氨酸和一個谷氨酰氨？煸愚Z擊質(zhì)譜中產(chǎn)生的肽段十分復雜，不易解析。
Hu and Loo(f8)用電噴霧質(zhì)譜研究了小白蛋白和鈣調(diào)素與鈣離子的化學結(jié)合計量數(shù)及其協(xié)同關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)小白蛋白的兩個鈣離子結(jié)合位點與鈣離子的結(jié)合有很強的協(xié)同性。在鈣離子濃度高時，鈣調(diào)素可以和四個鈣離子結(jié)合。第三個鈣離子和第四個鈣離子與鈣調(diào)素的結(jié)合有很強的協(xié)同性。鈣調(diào)素分子中與鈣離子結(jié)合的兩部分也有很強的相互作用。
5．結(jié)論
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