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  本文由論文第一作者李黎明博士受邀協(xié)助撰寫。

  中樞神經(jīng)系統(tǒng)在人體生命活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，脊髓損傷（SCI）是嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，往往致使患者損傷截?cái)嘁韵赂杏X和運(yùn)動(dòng)功能喪失，目前尚沒有有效的臨床治療手段。復(fù)雜的抑制性病理微環(huán)境是阻礙神經(jīng)修復(fù)的主要因素，對(duì)微環(huán)境的綜合調(diào)節(jié)是治療SCI的關(guān)鍵。高建青教授團(tuán)隊(duì)在前期研究中構(gòu)建了黏附性多肽修飾的生物相容性水凝膠，攜載間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell，MSC）進(jìn)行移植，對(duì)全橫斷型SCI的治療顯示了良好的效果（ACS Applied Materials & Interfaces, 2017, 9(4): 3330.），團(tuán)隊(duì)還針對(duì)SCI抑制性微環(huán)境，利用抗氧化性MnO2納米粒復(fù)合的水凝膠進(jìn)行微環(huán)境的抗氧化和抗炎調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)移植后的MSC細(xì)胞存活與脊髓神經(jīng)組織修復(fù)（ACS Nano, 2019, 13, 14283?14293）。近年研究發(fā)現(xiàn)，MSC的修復(fù)功能主要與其旁分泌作用有關(guān)，而干細(xì)胞在疾病微環(huán)境中較高的死亡率及潛在的長(zhǎng)期安全問題限制了其療效與應(yīng)用。作為MSC細(xì)胞旁分泌物的天然載體，MSC來源的外泌體繼承了MSC的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和炎癥、過氧化微環(huán)境調(diào)節(jié)等功能，因此，利用MSC外泌體替代MSC細(xì)胞進(jìn)行脊髓損傷局部的移植，是極具前景的SCI治療策略。由于SCI后組織中繼發(fā)性損傷的持續(xù)進(jìn)展與細(xì)胞外基質(zhì)缺失，外泌體在脊髓損傷局部的高效遞送與緩釋成為調(diào)節(jié)微環(huán)境和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵。

  高建青教授團(tuán)隊(duì)將藥劑學(xué)緩釋埋植制劑的技術(shù)應(yīng)用于組織再生與修復(fù)，通過層粘連蛋白來源多肽修飾的黏附性水凝膠三維攜載MSC細(xì)胞外泌體，補(bǔ)充損傷組織細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)，進(jìn)行外泌體在脊髓損傷局部的緩釋遞送移植。團(tuán)隊(duì)前期工作已證明層粘連蛋白來源的多肽PPFLMLLKGSTR可促進(jìn)MSC細(xì)胞與脊髓組織在透明質(zhì)酸（HA）水凝膠中的黏附生長(zhǎng)，鑒于MSC外泌體膜上同樣具有能與層粘連蛋白結(jié)合的整合素結(jié)構(gòu)，在本研究中，高建青教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步合成了可黏附性攜載外泌體的生物相容性水凝膠。實(shí)驗(yàn)表明，該水凝膠-外泌體三維體系的脊髓移植可實(shí)現(xiàn)外泌體在損傷脊髓組織中的保留和持續(xù)釋放以及向遠(yuǎn)端脊髓組織的融合，從而改善炎癥和過氧化微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)，最終顯著促進(jìn)了SCI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)并減輕其神經(jīng)源性膀胱損傷。

圖1. 研究示意圖。MSC細(xì)胞外泌體通過膜表面的整合素與水凝膠中的多肽結(jié)合從而黏附性包載于三維水凝膠中進(jìn)行脊髓損傷部位的移植，移植體系持續(xù)釋放外泌體以改善損傷微環(huán)境，從而促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)。

  研究團(tuán)隊(duì)采用基于尺寸排阻色譜原理的分離柱結(jié)合超速離心的方法成功提取獲得純化的MSC外泌體。分別合成醛基和氨基的修飾的HA，將層粘連蛋白來源的多肽PPFLMLLKGSTR與HA鏈上的部分醛基連接，利用席夫堿反應(yīng)構(gòu)建具有良好黏附性與生物相容性的水凝膠。肽修飾顯著提高了水凝膠對(duì)MSC外泌體的包載效率，MSC外泌體于水凝膠中黏附并呈現(xiàn)三維空間分布，體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示該體系可維持超過10天的外泌體釋放。

圖2.  外泌體的表征與在水凝膠中的黏附分布和釋放

  團(tuán)隊(duì)在前期研究中構(gòu)建了嚴(yán)重型的大鼠“大跨度”脊髓全橫切損傷模型，將大鼠脊髓通過手術(shù)暴露后，在T9-T10節(jié)段處完全切斷脊髓并制造4~5mm的斷口，將外泌體-水凝膠體系（Exo-pGel）移植入斷口部位進(jìn)行脊髓修復(fù)治療。在28天的治療周期內(nèi)，未進(jìn)行移植治療的SCI大鼠表現(xiàn)為后肢拖動(dòng)的癱瘓狀態(tài)，單獨(dú)移植空白水凝膠（Blank）對(duì)于大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)具有一定促進(jìn)效果，而Exo-pGel移植治療的大鼠可實(shí)現(xiàn)后肢關(guān)節(jié)的大幅活動(dòng)，表明該策略中局部遞送的外泌體所發(fā)揮的神經(jīng)修復(fù)作用。另外，對(duì)大鼠膀胱組織的考察表明，Exo-pGel移植治療能夠顯著改善SCI后的神經(jīng)源性膀胱損傷。對(duì)治療后脊髓神經(jīng)組織的解剖和免疫組化染色考察發(fā)現(xiàn)，Exo-pGel移植顯著緩解了炎性和過氧化性的損傷微環(huán)境，有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，促進(jìn)了損傷的脊髓神經(jīng)組織中神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)。

圖3.  大鼠脊髓全橫切損傷的外泌體-水凝膠移植治療顯著促進(jìn)后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)并緩解神經(jīng)源性膀胱損傷

圖4. 外泌體-水凝膠（Exo-pGel）移植與空白水凝膠（Blank）移植后28天脊髓神經(jīng)組織的修復(fù)效果

  高建青教授團(tuán)隊(duì)所構(gòu)建的生物相容性水凝膠黏附性攜載MSC細(xì)胞外泌體的三維移植體系，有效實(shí)現(xiàn)了對(duì)外泌體的脊髓局部遞送，從而達(dá)到治療SCI、重建運(yùn)動(dòng)功能的療效，該研究為基于外泌體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療及病理性微環(huán)境的調(diào)節(jié)提供了重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

  以上成果發(fā)表在Nano Letters雜志上 ，論文的第一作者為浙江大學(xué)藥學(xué)院博士后李黎明，通訊作者為高建青教授。

  論文鏈接：https://dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c00929