重慶大學(xué)蔡開勇/馮茜 Adv. Mater.：一石二鳥策略修復(fù)椎間盤髓核
椎間盤退變（IVDD）的病理生理過程極其復(fù)雜，包括NP細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）惡化、各種炎性細(xì)胞因子的釋放、纖維環(huán)破裂，繼而椎間盤高度和運(yùn)動性下降。同時，在IVDD過程中，IVD信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的紊亂和活性氧（ROS）的積累會進(jìn)一步促進(jìn)NP細(xì)胞凋亡，從而加重IVDD。大量臨床研究表明，ECM中ROS的水平與IVDD的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。ROS的過度積累會誘發(fā)過度的氧化應(yīng)激和NP損傷，最終導(dǎo)致IVD基質(zhì)的完整性受損。
鑒于此，重慶大學(xué)蔡開勇教授/馮茜副教授和華中科技大學(xué)李鋒教授等人設(shè)計了一種由HA-NCSN和Cu2+構(gòu)成的水凝膠，其在低度Cu2+濃度下表現(xiàn)出快速凝膠化、方便的注射和自愈特性以及出色的抗氧化能力。值得注意的是凝膠化過程中Cu2+被迅速還原，水凝膠顏色變黑且表現(xiàn)出高效的光熱性能。一方面，HA-NCSN/Cu水凝膠在抑制TNFα介導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激方面表現(xiàn)出顯著的功效，由于其ROS清除能力而增強(qiáng)了NP細(xì)胞的活性。另一方面，RNA測序（RNA-seq）分析表明，輕度PTT可以激活NP細(xì)胞的TGF-β/Smad通路，SMAD2/3的磷酸化證明了這一點，從而進(jìn)一步促進(jìn)ACAN和COL2的表達(dá)和分泌，這兩者都是髓核細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。
該研究成果于近日以“A One-Stone-Two–Birds Strategy for Intervertebral Disc Repair: Constructing a Reductive Chelation Hydrogel to Mitigate Oxidative Stress and Promote Disc Matrix Reconstruction”為題發(fā)表在Advanced Materials。重慶大學(xué)生物工程學(xué)院蔡開勇教授/馮茜副教授，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院李峰教授，卡托維茲西里西亞大學(xué)Serda, Maciej教授為通訊作者。重慶大學(xué)碩士研究生卜鵬真，華中科技大學(xué)博士研究生彭仁鵬，南方醫(yī)科大學(xué)張家明副研究員為論文的共同第一作者。
方案1展示了HA-NCSN/Cu 水凝膠通過抗氧化和光熱療法修復(fù)IVDD。HA-NCSN與Cu2+交聯(lián)形成水凝膠。將HA-NCSN/Cu水凝膠注入髓核，消除過量的ROS，從而保護(hù)NP細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。同時，光熱激活刺激NP細(xì)胞的TGF-/Smad通路，通過促進(jìn)ACAN和COL2的表達(dá)和分泌來加速受損ECM的修復(fù)，從而有效治療IVDD。
方案1. HA-NCSN/Cu 水凝膠抗氧化和光熱療法修復(fù) IVDD示意圖
【HA-NCSN/Cu 水凝膠的制備】
圖1首先展示了不同銅離子濃度下HA-NCSN/Cu水凝膠的制備，發(fā)現(xiàn)隨著Cu2+濃度增加，水凝膠的交聯(lián)密度增強(qiáng)，微孔尺寸減小。掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）表明，水凝膠具有均勻的多孔結(jié)構(gòu)，Cu2+均勻分布，并形成了2-4納米的納米顆粒簇。X射線光電子能譜（XPS）分析顯示，部分Cu2+在凝膠過程中被還原為Cu+，表明硫脲基團(tuán)與Cu2+之間發(fā)生了強(qiáng)烈的配位反應(yīng)；诘谝恍栽淼Bader電荷分析也表明，硫脲基團(tuán)將部分電子轉(zhuǎn)移到Cu2+，從而降低其氧化態(tài)。
圖1. HA-NCSN/Cu水凝膠的制備
【HA-NCSN/Cu 水凝膠的特性】
圖2展示了了HA-NCSN/Cu水凝膠的流變學(xué)性質(zhì)、抗氧化性能、光熱效應(yīng)及其在IVDD治療中的潛力。結(jié)果表明，HA-NCSN/Cu水凝膠具備優(yōu)異的剪切稀化、自愈性和抗疲勞性能，且表現(xiàn)出良好的注射性和機(jī)械強(qiáng)度，尤其是HA-NCSN/Cu3，具有類似人髓核的彈性模量。水凝膠的抗氧化能力可有效清除DPPH和OH·自由基，主要歸因于HA-NCSN聚合物。通過近紅外光照射，HA-NCSN/Cu水凝膠表現(xiàn)出極好的光熱效應(yīng)，并具備可控性和可重復(fù)性。體內(nèi)實驗表明，水凝膠在髓核組織內(nèi)可通過外部近紅外光觸發(fā)加熱，為體內(nèi)光熱治療提供了基礎(chǔ)。
圖2 HA-NCSN/Cu水凝膠的特性
【HA-NCSN/Cu水凝膠在炎癥環(huán)境下對NP細(xì)胞的保護(hù)作用】
圖3展示了水凝膠對NP細(xì)胞炎性的抑制作用。通過HA-NCSN/Cu3水凝膠進(jìn)行體外和體內(nèi)實驗，評估其對髓核細(xì)胞（NP細(xì)胞）的生物相容性和抗炎效果。CCK-8實驗結(jié)果表明，HA-NCSN/Cu水凝膠在近紅外（NIR）照射下不影響細(xì)胞活性和增殖。HA-NCSN/Cu水凝膠顯著抑制了TNFα誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)了膠原Ⅱ（Col2a1）和聚集蛋白（Acan）的基因表達(dá)，并降低了Mmp3和Mmp13的基因表達(dá)，顯示出有效的抗炎作用。與HA-NCSN/Cu組相比，HA-NCSN/Cu+NIR組顯示出更優(yōu)的治療效果，表明其光熱性能對抑制炎癥、促進(jìn)NP細(xì)胞活性及加速IVDD修復(fù)具有重要作用。
圖3. 體外 NP 細(xì)胞再生評估
【HA-NCSN/Cu水凝膠清除ROS對NP細(xì)胞的影響】
為了進(jìn)一步探討HA-NCSN/Cu水凝膠抗氧化和光熱作用調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞的機(jī)制，研究通過RNA-seq分析了不同處理組（TNFα、TNFα/HA-NCSN/Cu、TNFα/HA-NCSN/Cu+NIR）對髓核細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，TNFα處理上調(diào)了1546個基因，下調(diào)了1015個基因，而HA-NCSN/Cu處理則調(diào)節(jié)了553個基因的上調(diào)和582個基因的下調(diào)。KEGG分析揭示，PI3K-Akt、TNF和IL-17信號通路在TNFα/HA-NCSN/Cu組中發(fā)生顯著變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HA-NCSN/Cu水凝膠通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝通路（GSH）抑制ROS生成，顯著提高了抗氧化因子Nrf2和Hmox1的表達(dá)，表明其具有抗氧化和清除ROS的作用，從而保護(hù)髓核細(xì)胞免受炎癥和氧化損傷。
圖 4. HA-NCSN/Cu 水凝膠抑制 TNFα 誘導(dǎo)的 氧化應(yīng)激。
【HA-NCSN/Cu水凝膠通過光熱效果激活TGF-β信號通路影響髓核細(xì)胞】
進(jìn)一步比較了TNFα/HA-NCSN/Cu組與TNFα/HA-NCSN/Cu+NIR組的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異。結(jié)果顯示，NIR誘導(dǎo)了158個基因上調(diào)和181個基因下調(diào)。KEGG分析表明，TGF-β信號通路在TNFα/HA-NCSN/Cu+NIR組中顯著變化，GSEA分析也顯示所有差異表達(dá)基因（DEGs）顯著富集于TGF-β信號通路。熱圖分析揭示，NIR顯著影響了與TGF-β通路相關(guān)的基因表達(dá)，Smad家族蛋白在該通路中起核心作用。TGF-β信號通路對髓核退變（IVDD）具有保護(hù)作用，可促進(jìn)基質(zhì)合成、抑制基質(zhì)降解和炎癥反應(yīng)。Western blot結(jié)果顯示，NIR顯著上調(diào)了磷酸化Smad2（pSMAD2）和磷酸化Smad3（pSMAD3）的蛋白水平，表明TGF-β通路被激活。綜上所述，HA-NCSN/Cu水凝膠結(jié)合光熱治療（PTT）通過激活TGF-β/Smad信號通路，有助于抵抗TNFα誘導(dǎo)的炎癥損傷。
圖 5. RNA-seq 顯示 HA-NCSN/Cu/NIR 激活 TGF-β 信號通路。
【使用大鼠 IVD 模型進(jìn)行體內(nèi)評估】
圖6展示了用針刺誘導(dǎo)的SD大鼠IVDD模型評估HA-NCSN/Cu水凝膠在體內(nèi)的治療效果。實驗分為四組：未針刺組（對照組）、針刺組、HA-NCSN/Cu水凝膠注射組和HA-NCSN/Cu水凝膠注射+NIR組。CT成像顯示，HA-NCSN/Cu和HA-NCSN/Cu+NIR組在術(shù)后8周的椎間盤高度指數(shù)（DHI%）顯著高于針刺組。組織學(xué)評估結(jié)果顯示，針刺組（組II）表現(xiàn)出嚴(yán)重的細(xì)胞浸潤和高度紊亂的盤結(jié)構(gòu)，而HA-NCSN/Cu組和HA-NCSN/Cu+NIR組則顯示出較為完整的髓核和有序的纖維環(huán)組織。免疫組化結(jié)果也表明，HA-NCSN/Cu水凝膠顯著增加了COL2A1和ACAN的表達(dá)，并降低了MMP3和MMP13的表達(dá)，表明HA-NCSN/Cu水凝膠結(jié)合NIR可有效延緩IVDD進(jìn)程并促進(jìn)其再生。
圖 6. 使用大鼠IVD模型進(jìn)行體內(nèi)評估。
【小結(jié)】
本文開發(fā)了一種還原性交聯(lián)的HA-NCSN/Cu水凝膠，并探索了其對IVDD的治療效果。HA-NCSN/Cu的合成簡單高效，具有可注射性、自修復(fù)、ROS清除和光熱特性等特性；谄淇寡趸凸鉄崽匦缘膮f(xié)同作用，一石二鳥設(shè)計已成功證明用于逆轉(zhuǎn)NP細(xì)胞損傷。一方面，HA-NCSN優(yōu)異的ROS清除能力緩解了炎癥微環(huán)境，并調(diào)節(jié)了NP細(xì)胞的ROS生成相關(guān)谷胱甘肽代謝信號通路。另一方面，PTT顯著上調(diào)NP 細(xì)胞COLL2和ACAN的表達(dá)，同時下調(diào) MMP3和MMP13的表達(dá)。此外，輕度PTT還通過激活TGF-β/Smad信號通路增強(qiáng)了IVDD的ECM再生。體內(nèi)實驗最終驗證了HA-NCSN/Cu通過協(xié)同處理實現(xiàn)了顯著的IVD再生。這些結(jié)果表明，基于HA-NCSN/Cu水凝膠的微創(chuàng)協(xié)同治療在逆轉(zhuǎn)IVDD方面具有巨大的治療潛力，其中輕度PTT可能為IVDD治療提供新的見解。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202411290
