80电影天堂网,少妇高潮一区二区三区99,jαpαnesehd熟女熟妇伦,无码人妻精品一区二区蜜桃网站

  骨骼肌的損傷十分常見(jiàn)，如肌中毒、過(guò)高或過(guò)低的溫度、創(chuàng)傷性損傷以及先天性殘疾、退行性肌病等。肌肉自發(fā)修復(fù)需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的恢復(fù)時(shí)間且效果有限，手術(shù)植入組織工程構(gòu)建體的方法一般具有較大的創(chuàng)傷性并容易帶來(lái)副作用，而微創(chuàng)性直接注射細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)的方法則面臨所注射細(xì)胞從理想的作用位點(diǎn)高度遷移、存活率低等問(wèn)題，修復(fù)效果不理想。

  華僑大學(xué)陳愛(ài)政教授課題組和哈佛醫(yī)學(xué)院Yu Shrike Zhang（張宇）教授課題組以聚乳酸羥基乙酸（poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA）為原料，通過(guò)微流控技術(shù)制備高度貫通多孔微載體（highly open porous microspheres, HOPMs），并通過(guò)Minitab全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，考察結(jié)果表明聚合物濃度、致孔劑濃度對(duì)微載體粒徑和孔徑的影響顯著；而水油比對(duì)微載體粒徑和孔徑的影響不顯著。另外，結(jié)果表明微流控技術(shù)制備微載體過(guò)程，受到水-油界面張力和連續(xù)相流體剪切力的共同作用。通過(guò)改變針頭尺寸、乳化功率和連續(xù)相/分散相流速比，可成功地制備參數(shù)可控的可注射型微載體。

圖1. 不同制備工藝下制備的PLGA LPMs掃描電鏡圖

  為考察所制備的HOPMs能否有效地作為C2C12細(xì)胞運(yùn)載體，對(duì)比了靜態(tài)培養(yǎng)以及三維微重力培養(yǎng)，結(jié)果表面其能很好地支持細(xì)胞黏附、增殖和生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，C2C12細(xì)胞在微載體上具有較高的黏附率，且動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方式較靜態(tài)培養(yǎng)方式有更高的黏附率。說(shuō)明微載體的預(yù)處理過(guò)程增加了蛋白質(zhì)的吸附量，改善了PLGA微載體的疏水性，并能較好的模擬生物體內(nèi)的三維生長(zhǎng)環(huán)境，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和代謝廢物等傳質(zhì)，介導(dǎo)后續(xù)C2C12細(xì)胞的黏附。同時(shí)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡層掃疊加圖可以看出，HOPMs接種細(xì)胞并體外培養(yǎng)3天后，大部分細(xì)胞黏附在微載體表面，其內(nèi)部細(xì)胞較少。但當(dāng)接種時(shí)間延長(zhǎng)到12天時(shí)，細(xì)胞占據(jù)整個(gè)微載體，并且微載體表面的孔結(jié)構(gòu)完全被C2C12細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)所覆蓋。在分子水平檢測(cè)表明，復(fù)合體在體外在連續(xù)培養(yǎng)20天后，MyoD1、Myf 5及Pax7等成肌相關(guān)的分子標(biāo)志表達(dá)相對(duì)較高，說(shuō)明HOPMs具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)肌向分化的能力以及優(yōu)異的成肌性能。

圖2. （A-i）HOPMs與C2C12共培養(yǎng)后在不同時(shí)間段的CLSM 圖，靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞粘附率(A-ii)及細(xì)胞增值率(A-iii)。（B）細(xì)胞裝載HOPMs培養(yǎng)不同時(shí)間后的CLSM層掃疊加圖。（C）細(xì)胞裝載HOPMs的免疫熒光染色圖。（D）細(xì)胞裝載HOPMs的H&E染色圖。（E）細(xì)胞裝載HOPMs的MyoD1、Myf 5及Pax 7的特性表達(dá)水平。

  為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)該高度貫通多孔微載體用于骨骼肌細(xì)胞微創(chuàng)原位遞送的可行性，將細(xì)胞裝載的HOPMs皮下注射入正常裸鼠體內(nèi)，并研究其體內(nèi)增殖和分化情況。相較于直接注射細(xì)胞而言，HOPMs可以更好地固定細(xì)胞，避免細(xì)胞從靶向部位遷移。從H&E染色、Masson染色可以觀察到HOPMs注射部位形成有序、密集的肌肉束結(jié)構(gòu)，同時(shí)細(xì)胞凋亡檢測(cè)說(shuō)明HOPMs具有很好的生物相容性。

圖3. 細(xì)胞裝載HOPMs的體內(nèi)療效。（A）裸鼠經(jīng)注射i）生理鹽水，ii）HOPMs微載體懸浮于PBS， iii）懸浮細(xì)胞（8×10⁶個(gè)/mL）懸浮于PBS，和iv）細(xì)胞裝載HOPMs懸浮在PBS一段時(shí)間后生長(zhǎng)情況照片。（B） H&E染色。（C） Masson染色。（D）治療6周后小鼠移植組織Tunel檢測(cè)：i）懸浮細(xì)胞（8×10⁶個(gè)/mL）懸浮于PBS，ii）細(xì)胞裝載HOPMs懸浮于PBS。（E）ACE 2和VEGF-A基因表達(dá)。（F）Western blot檢測(cè)血管生物標(biāo)志物（ACE 2，7VEGF-A，GAPDH）。

  在組織再生過(guò)程中，血管化在其生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用，因?yàn)樗ㄟ^(guò)提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和清除代謝廢物來(lái)維持止血。通過(guò)分析血管相關(guān)特異性基因，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE 2）和血管緊張素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-A）可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞裝載的HOPMs治療組表現(xiàn)出更高的血管相關(guān)基因表達(dá)。H&E染色和Masson染色也顯示HOPMs治療組有微血管在新形成的肌肉組織中向內(nèi)生長(zhǎng)。通過(guò)肌源性標(biāo)記物Desmin、MYH1、平滑肌肌動(dòng)蛋白（SMA）、CD31的免疫組化染色進(jìn)一步證實(shí)成肌細(xì)胞的血管化、分化及成熟。

圖4. 免疫組化分析。A）空白組和B）細(xì)胞裝載的HOPMs治療組成肌細(xì)胞特異性（Desmin，MYH1）和血管特異性標(biāo)志物（SMA, CD31）免疫組化染色。

  綜上所述，該微流控技術(shù)制備高度貫通多孔微載體用于骨骼肌細(xì)胞微創(chuàng)原位遞送為修復(fù)組織缺損及后續(xù)的肌肉再生研究提供新思路。

  以上相關(guān)成果于6月21日正式發(fā)表在Small（DOI:10.1002/smll.201901397）,并被選為封面論文（Front cover）。論文共同第一作者為華僑大學(xué)生物材料與組織工程研究所Ranjith Kumar Kankala博士和2018屆碩士畢業(yè)生趙佳，通訊作者為哈佛醫(yī)學(xué)院張宇（Y. Shrike Zhang）教授和華僑大學(xué)陳愛(ài)政教授。華僑大學(xué)博士生劉晨光、碩士生宋曉杰、王士斌教授和福建醫(yī)科大學(xué)楊達(dá)云博士、復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院朱鎧博士為論文的共同作者。

  研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合重點(diǎn)項(xiàng)目《可注射型復(fù)合生物支架介導(dǎo)血管化肌組織原位再生的研究》（U1605225）及福建省生物材料科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目的資助。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1002/smll.201901397