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  細(xì)胞培養(yǎng)肉作為一種顛覆性的肉類(lèi)生產(chǎn)技術(shù)，旨在通過(guò)體外大規(guī)模擴(kuò)增并誘導(dǎo)分化肌肉干細(xì)胞以獲得與真實(shí)肉相似口感及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的肉替代產(chǎn)品，具有綠色可持續(xù)、營(yíng)養(yǎng)可控、環(huán)境污染小等優(yōu)勢(shì)，是未來(lái)食品的重要發(fā)展趨勢(shì)。該技術(shù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一在于可食用三維生物支架的開(kāi)發(fā)。三維生物支架具有與細(xì)胞外基質(zhì)相似的微觀結(jié)構(gòu)，可為細(xì)胞黏附、增殖和分化提供指導(dǎo)，促進(jìn)氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換。用于培養(yǎng)肉的支架材料應(yīng)是可食用和消化的、有良好的細(xì)胞親和性并能大規(guī)模和低成本獲得的。

  靜電場(chǎng)電流體噴射3D打印技術(shù)（EHDP）能夠制備微結(jié)構(gòu)可控的超細(xì)纖維支架，因其纖維尺寸與細(xì)胞大小相似，可以高度還原細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，從而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)行為，被廣泛用于三維細(xì)胞培養(yǎng)與組織工程等領(lǐng)域。然而，由于該技術(shù)對(duì)打印墨水的性質(zhì)有很高的要求，目前尚可應(yīng)用的墨水材料十分有限且多為合成高分子材料，難以滿足制作細(xì)胞培養(yǎng)肉的基本需求，故制造可食用級(jí)的3D打印支架還需探索食品級(jí)墨水材料。

  近日，新加坡國(guó)立大學(xué)食品科學(xué)與工程系黃德建教授團(tuán)隊(duì)首次以谷物醇溶蛋白（玉米、大麥和黑麥蛋白）為原料，成功制備具有合適流變性質(zhì)的純植物基墨水，并通過(guò)高精度3D打印技術(shù)制造了微結(jié)構(gòu)可控的谷物醇溶蛋白纖維支架，由此制備出具有組織相似性的細(xì)胞培養(yǎng)豬肉片原型，為細(xì)胞培養(yǎng)肉的生產(chǎn)提供了新思路。

圖1、 基于靜電場(chǎng)電流體噴射打印技術(shù)（EHDP）生產(chǎn)可食用醇溶蛋白支架及細(xì)胞培養(yǎng)肉的示意圖

  為獲取制備三維支架的原料，首先從谷物中提取出醇溶蛋白，包括玉米醇溶蛋白（zein）、黑麥醇溶蛋白（secalin）及大麥醇溶蛋白（hordein）。通過(guò)調(diào)整醇溶蛋白墨水濃度和不同醇溶蛋白的比例，獲得與EHDP技術(shù)常用的聚酯內(nèi)酯（PCL）墨水具有相似流變行為及電導(dǎo)性能的純植物蛋白墨水。在靜電場(chǎng)電流體噴射打印平臺(tái)上，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)打印針頭噴射溶液的狀態(tài)，優(yōu)化打印條件（包括加載電壓、針頭-底板間距離、環(huán)境溫度和濕度等），從而獲得穩(wěn)定的噴射泰勒錐，形成連續(xù)沉積纖維。通過(guò)設(shè)計(jì)打印程序，EHDP技術(shù)可精確控制可食用谷物醇溶蛋白支架（zein/hordein及zein/secalin）的微觀結(jié)構(gòu)，包括纖維直徑、孔徑、孔隙、孔型和厚度等。通過(guò)掃描電鏡觀察到打印的谷物醇溶蛋白支架呈孔徑為400 μm的多層有序多孔結(jié)構(gòu)。在維持良好力學(xué)性能的同時(shí)，支架的孔隙率高達(dá)88%，其有利于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及廢物運(yùn)輸（圖2）。

圖2、 （A）zein/secalin支架實(shí)物圖；（B-D）zein/hordein、（E）zein/secalin、（F）PCL支架的SEM微觀結(jié)構(gòu)圖；（G-H） 醇溶蛋白支架的水合作用；（I）醇溶蛋白支架的力學(xué)性質(zhì)。

  為深入探究醇溶支架在細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用潛能，以骨骼肌細(xì)胞為模型，在支架上觀察細(xì)胞行為。研究發(fā)現(xiàn)，C2C12小鼠成肌細(xì)胞與豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在醇溶蛋白支架上具有良好的黏附能力。經(jīng)過(guò)11天培養(yǎng)后，細(xì)胞數(shù)量分別擴(kuò)增至30倍和10倍以上，通過(guò)共聚焦顯微成像可以觀察到細(xì)胞逐漸填滿支架的孔隙，表明支架良好的生物相容性。此外，區(qū)別于二維貼壁生長(zhǎng)，三維支架上生長(zhǎng)的骨骼肌細(xì)胞較為細(xì)長(zhǎng)，具有與體內(nèi)肌肉組織更相似的微觀形貌（圖3）。

圖3、 （A）C2C12細(xì)胞和（B）豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在PCL及醇溶蛋白支架上的增殖；（C）C2C12細(xì)胞和（D）豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的共聚焦熒光顯微成像圖；（E）2D平板和3D支架培養(yǎng)下細(xì)胞的形貌對(duì)比（藍(lán)色：DAPI，紅色：鬼筆環(huán)肽）。

  為誘導(dǎo)骨骼肌干細(xì)胞分化形成成熟肌管，在血清饑餓誘導(dǎo)7天后，C2C12成肌細(xì)胞的結(jié)蛋白（desmin）、肌細(xì)胞生成素（myogenin）及肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain）表達(dá)量顯著升高，標(biāo)志成肌細(xì)胞的分化與成熟。有趣的是，在血清饑餓前，支架培養(yǎng)的細(xì)胞肌球蛋白重鏈蛋白的表達(dá)量已顯著高于二維培養(yǎng)，說(shuō)明三維支架培養(yǎng)可加速成肌細(xì)胞分化。同時(shí)，在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的肌細(xì)胞生成素表達(dá)量也顯著提高，進(jìn)一步表明干細(xì)胞在三維支架培養(yǎng)上的分化潛能（圖4）。

圖4、 （A）C2C12細(xì)胞和（B）豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞黏附相關(guān)基因的表達(dá)；（C）C2C12細(xì)胞和（D）豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞肌源調(diào)控因子的表達(dá)；（E）骨骼肌干細(xì)胞分化示意圖（藍(lán)色：DAPI，紅色：鬼筆環(huán)肽）。

  此外，醇溶蛋白支架具有良好的穩(wěn)定性，在培養(yǎng)細(xì)胞后，仍維持原有的微結(jié)構(gòu)。值得一提的是，在細(xì)胞培養(yǎng)一周后，蛋白纖維表面自發(fā)形成微孔結(jié)構(gòu)，說(shuō)明體外降解性。作為概念性的驗(yàn)證，通過(guò)在蛋白支架上連續(xù)培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化肌肉干細(xì)胞12天后，可以獲得直徑為2.5厘米的人造豬肉片。

圖5 （A）醇溶蛋白支架在PBS中浸泡7天、（B）培養(yǎng)肌肉細(xì)胞2天、（C-D）培養(yǎng)5天后的形貌圖；（E-F）人造肉模型。

  文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adma.202207397

  DOI: https://doi.org/10.1002/adma.202207397